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        沙棘多糖對撲熱息痛誘導的小鼠肝損傷保護作用的研究①

        2018-08-01 04:07:12王昕旭張曉慧劉春妍王玉珍趙世敏
        中國免疫學雜志 2018年7期
        關鍵詞:藥物性沙棘炎性

        王昕旭 王 雪 張曉慧 鄒 凱 劉春妍 顏 妍 王玉珍 趙世敏

        (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,呼和浩特 010018)

        沙棘(Hippophae rhamnoides,Linn.),為胡頹子科沙棘屬植物,落葉灌木或小喬木,又名醋柳、酸刺等。沙棘果中營養(yǎng)物質(zhì)十分豐富,其許多成分在腫瘤的預防治療以及增強免疫力、抗衰老、防止血管栓塞等方面有著很好的效果,具有很高的藥用價值[1]。多糖是有機體必需物質(zhì),與維持生物機能密切相關,而天然多糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒等許多生物學功能,近年來也受到了廣泛的重視和研究,其中又以植物多糖研究最為廣泛[2-5]?!吨嗅t(yī)大辭典》記載沙棘果有活血散瘀、化痰寬胸、補脾健胃、生津止渴、清熱止瀉等之功效。目前,對于沙棘也進行了一些研究[6],但對于其多糖的研究并不廣泛,在藥物性肝損傷方面的研究也不是很多,所以,本實驗以從沙棘果中提取的沙棘多糖(Seabucthorn polysaccharide,SP)為研究對象,探究其在撲熱息痛(Acetaminophen,APAP)誘導的小鼠藥物性肝損傷組織中的保護作用。

        APAP是臨床上一種常見的非抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥,在其規(guī)定的劑量范圍內(nèi),其治療效果良好且無副作用,如若超過其服用劑量,則會造成嚴重的急性肝損傷以及腎功能衰竭,嚴重的患者還可導致死亡。在發(fā)達國家,APAP導致的急性肝損傷的發(fā)展趨勢迅猛,已經(jīng)在一定程度上影響了人們的生活質(zhì)量。其中對于那些常規(guī)治療無效者,肝移植是唯一挽救的方法[7],不過,即使在滿足標準的患者中,超過20%將在1年內(nèi)死亡,而一半患者將在未來10年內(nèi)死亡[8]。由此可見,APAP所引起的肝損傷情況并不樂觀,所以,對于藥物性肝損傷的預防與治療也尤為受到關注。

        藥物性肝損傷是一個多因素多機制的復雜過程,其發(fā)病機制不僅與氧化應激有關,炎癥反應在其發(fā)生、發(fā)展進程及預后中也起到重要作用[8]。肝臟是人體重要的免疫器官,在藥物性肝損傷發(fā)病過程中,炎癥反應是造成肝損傷的主要原因和重要機制之一[9],其主要促成因素是Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR),TLR通過與配體結(jié)合誘導腫瘤壞死因子-α(Tumor necroisi factor α,TNF-α)、IL-1β和IL-6等促炎性細胞因子的產(chǎn)生,從而加劇藥物性肝損傷的發(fā)生[10]。

        1 材料與方法

        1.1實驗動物、試劑 8周齡雄性C57BL/6小鼠40只,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;APAP和NAC購自阿拉丁試劑公司;組織蛋白提取液購自康為世紀生物有限公司;BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自上海生物工程有限公司;總 RNA 抽提試劑 Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa生物公司;TLR4一抗購自美國 Cell Signaling 公司;Western blot二抗購自 LI-COR 公司。

        1.2方法

        1.2.1沙棘多糖的提取與測定 采用水提醇沉法提取沙棘果實多糖組分[11]。沙棘漿果粉采用固體:液比1∶20(w/v)的比例熱水提取4次(80℃),之后乙醇分級沉淀,Sevage法去除蛋白,木瓜蛋白酶消化。SP經(jīng)Sephadex G150凝膠(Pharmacia)后高效液相色譜法檢測其純度。結(jié)果表明,SP由75%糖、14.2%糖醛酸組成。色譜分析顯示,多糖是由甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和鼠李糖組成,其摩爾比為:2.02∶1.02∶4.24∶1∶9.22[11]。

        1.2.2APAP藥物性肝損傷模型的構(gòu)建 C57BL/6系雄性系小鼠隨機分為6組,每組6只,即空白組(Ctrl)、APAP模型組(APAP,350 mg/kg)、N-乙酰半胱氨酸組(NAC,150 mg/kg)、SP低劑量組(APAP/SP100,100 mg/kg)、SP高劑量組(APAP/SP200,200 mg/kg)和SP對照組(SP200,200 mg/kg),SP連續(xù)灌胃30 d,空白組和模型組灌等體積的生理鹽水,NAC在造模1 h前腹腔注射,16 h后將小鼠處死,采集血清以及肝臟樣本用于后續(xù)試驗。

        1.2.3血清中ALT、AST檢測 小鼠血清經(jīng)過離心稀釋處理之后由內(nèi)蒙古人民醫(yī)院全自動生化分析儀測其ALT、AST水平。檢測結(jié)果由內(nèi)蒙古人民醫(yī)院檢測科提供。

        1.2.4肝臟病理學檢測 通過事先固定好的肝組織用石蠟切片包埋,并制成5 μm的薄片,采用蘇木素-伊紅染色法,之后在光學顯微鏡下觀察肝組織整體情況以及細胞的結(jié)構(gòu)形態(tài),炎性浸潤情況,細胞核結(jié)構(gòu)完整性等。

        1.2.5Western blot檢測 肝臟組織按照重量∶體積=1∶9的比例加入組織蛋白抽提液,經(jīng)破碎后4 000 r/min離心10 min,即得到10%的肝臟勻漿,利用BCA試劑盒方法檢測蛋白質(zhì)含量。檢測濃度之后各組取等量蛋白提取液,經(jīng)SDS-PAGE 泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上;取膜并用脫脂奶粉封閉后,與兔抗鼠TLR4的單克隆抗體(1∶1 000)于 4℃ 反應過夜,洗膜后再與羊抗兔 IRDye800CW 二抗(1∶15 000)室溫反應 2 h,洗膜后利用 ODYSSEY CLX 檢測特異性蛋白條帶,采用 Imagine Studio 軟件分析。

        1.2.6Real-time PCR分析 采用Trizol法提取肝組織中的RNA,上樣量為500 ng進行反轉(zhuǎn)錄PCR,引物序列見表1,Real-time PCR 計算方法采用 2-ΔΔCT法。

        1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)間顯著性差異通過SPSS鄧肯氏多重比較法計算,P<0.01認為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1SP對血清中ALT、AST水平的影響 SP采用連續(xù)灌胃30 d的方式來評估其安全性。如圖1所示,SP對照組(SP200,200 mg/kg)ALT和AST的活性與空白組小鼠的活性沒有顯著差異,表明SP給藥不誘導肝毒性,是安全可用的;與空白組相比,模型組的ALT和AST水平明顯提高,SP各劑量組的水平明顯降低且呈一定的劑量依賴性,各劑量組與模型組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

        表1Real-timePCR引物序列

        Tab.1PrimersequencesofReal-timePCR

        PrimernamePrimersequenceIL?6antisense5′?TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC?3′IL?6sense5′?TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC?3′TNF?αantisense5′?TTGATGGTGGTGCATGAGAG?3′TNF?αsense5′?AAACACAAGATGCTGGGACA?3′

        2.2SP對APAP誘導的肝損傷的影響 利用石蠟包埋小鼠肝組織并切成薄片,HE染色,在200倍光學顯微鏡下,觀察小鼠肝組織情況。如圖2所示在空白組(生理鹽水)中,肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細胞核無損壞;與空白組相比,模型組(APAP,350 mg/kg)能夠看到明顯的肝細胞核破裂,肝細胞的壞死,炎性細胞浸潤以及壞死灶;SP低劑量組(APAP/SP100,100 mg/kg)中仍能看到多個壞死灶;而在SP高劑量組(APAP/SP200,200 mg/kg)以及N-乙酰半胱氨酸組(NAC,150 mg/kg)中顯示肝細胞的損壞情況以及炎性細胞浸潤,壞死灶等均有所的減輕;SP對照組(SP200,200 mg/kg)中可見細胞狀態(tài)正常,無損傷產(chǎn)生。說明SP能夠通過抑制肝損傷組織中炎癥,起到保肝的效果。

        2.3SP對肝組織TLR4和p-JNK的影響 如圖3所示,與空白組相比,SP對照組表達正常,而模型組TLR4表達量顯著提高(P<0.01);N-乙酰半胱氨酸組、SP劑量組與模型組相比均明顯降低(P<0.01)?;叶葤呙杞Y(jié)果也顯示,模型組含量顯著提高(P<0.01),SP各劑量組與模型組相比均明顯降低(P<0.01)。說明SP可以顯著抑制TLR4的活化(P<0.01)。在圖4中,相對于空白對照組,SP對照組表達正常,模型組p-JNK明顯升高(P<0.01),SP各劑量組顯著下降(P<0.01),高劑量組效果最為顯著,灰度掃描結(jié)果相同,說明SP對p-JNK有抑制作用。

        圖1 SP對血清ALT和AST水平的影響Fig.1 Effects of SP on serum levels of ALT and ASTNote:**.P<0.01.

        圖2 SP對肝組織的影響(HE 染色,×200)Fig.2 Effects of SP on liver tissues(HE staining,×200)

        2.4SP對炎性細胞因子的影響 如圖5所示,相比空白對照組,SP對照組表達正常,模型組中的TNF-α和IL-6表達量均明顯升高(P<0.01),N-乙酰半胱氨酸組和SP高劑量組中TNF-α和IL-6的表達量顯著降低(P<0.01),表明高劑量SP對促炎性因子TNF-α和IL-6有抑制作用(P<0.01)。

        圖3 Western blot檢測沙棘多糖對TLR4的影響Fig.3 Effects of SP on TLR4 as detected by Western blotNote:**.P<0.01.

        圖4 Western blot檢測沙棘多糖對p-JNK的影響Fig.4 Effects of SP on p-JNK as detected by Western blotNote:**.P<0.01.

        圖5 Real-time PCR檢測沙棘多糖對炎癥細胞因子的影響Fig.5 Effects of SP on inflammatory cytokines as detected by Real-time PCRNote:**.P<0.01.

        3 討論

        實驗前期研究結(jié)果表明,SP具有抗炎和抗氧化作用,可以拮抗內(nèi)毒素性肝損傷以及刺激巨噬細胞的活化與增殖[12,13]。本實驗是進一步探究SP對藥物性肝損傷的保護作用,采用實驗室自提SP作為治療藥物,NAC(臨床上拮抗APAP毒性的一種治療藥物)作為陽性對照,研究SP對APAP誘發(fā)的藥物性肝損傷組織的保護作用機制,發(fā)揮保肝作用。在以上結(jié)果中顯示,SP對照組與空白組相比,其所有指標均處于正常水平,說明SP給藥并不引起肝損傷,是安全可靠的;SP劑量組能夠有效地降低血清中ALT、AST水平,證實了SP對APAP誘發(fā)的藥物性肝損傷有保護作用;在HE染色中我們也進一步觀察到SP劑量組能夠改善肝細胞的損壞、炎性細胞浸潤以及壞死灶的程度,發(fā)揮了保肝的功效;Western blot檢測了TLR4、p-JNK、p-erk、p-p38的表達,其中p-erk與p-p38的SP治療組與模型組相比,沒有顯著的降低,因此數(shù)據(jù)中并未顯示。但在SP對TLR4和p-JNK的結(jié)果中表明SP劑量組能夠顯著抑制藥物性肝損傷組織中TLR4和p-JNK的表達,說明SP是通過抑制TLR4-p-JNK通路而減輕肝損傷;Real-time PCR結(jié)果也顯示,SP高劑量(200 mg/kg)下對TNF-α、IL-6的表達具有明顯的抑制作用。

        綜上所述,本研究可以證明SP能通過抑制APAP誘導的小鼠急性肝損傷組織中的TLR4-p-JNK通路,抑制促炎性因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎活性,減輕肝損傷程度,保護肝臟免受藥物損害,為藥物性肝損傷的治療提供了新途徑,也為SP作為治療APAP誘導的藥物性肝損傷的食用保健型藥物提供了依據(jù)。

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