季坤源，高 慧，董巧香*

(溫州醫(yī)科大學(xué)a檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，b公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

納米顆粒，又稱(chēng)超細(xì)粒子，其粒徑介于1～100 nm之間，具有宏觀材料不具有的許多優(yōu)異特性，如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和量子隧穿效應(yīng)等[1-2]。隨著科技的發(fā)展，納米材料逐漸走入人們生活。納米二氧化鈦是應(yīng)用最廣泛的納米材料之一，廣泛應(yīng)用于化妝品、紡織品、遮光劑、消毒劑以及運(yùn)動(dòng)用品等。研究發(fā)現(xiàn)，在暴露納米二氧化鈦的小鼠肝臟、肺、腦可以檢測(cè)到納米顆粒的存在。

隨著納米材料應(yīng)用的普及，近年來(lái)它的安全性也受到普遍關(guān)注[3]。納米二氧化鈦可通過(guò)呼吸道達(dá)到肺泡末端，誘發(fā)肺的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，長(zhǎng)期會(huì)造成肺的纖維化[4]，同時(shí)納米二氧化鈦可進(jìn)入血液[5-6]，影響大腦功能[7]，造成肝臟損傷[8]等。研究發(fā)現(xiàn)，與柴油機(jī)尾氣中的顆粒物和炭黑等納米粒子相比，納米二氧化鈦對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞有更強(qiáng)的毒性。納米二氧化鈦可透過(guò)雄性小鼠血睪屏障，導(dǎo)致雄性小鼠的體重增長(zhǎng)率、精子質(zhì)量與活性遠(yuǎn)低于對(duì)照組[9]。青春期雄性小鼠暴露于不同濃度的納米二氧化鈦，成年后采集血清與睪丸進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦的濃度越高，小鼠血清睪酮的含量越低，睪丸組織學(xué)改變程度越大[10]。Gao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦可顯著降低雌性小鼠血清雌激素的含量，小鼠卵巢功能下降。納米二氧化鈦可能通過(guò)影響性激素水平或性激素信號(hào)通路，從而影響睪丸和卵巢[10-11]。

本研究采用C57BL/6-GFP品系的雌性小鼠為模型，研究納米二氧化鈦暴露對(duì)青春期小鼠乳腺發(fā)育影響。通過(guò)對(duì)乳腺的異常變化分析納米二氧化鈦在乳腺病變發(fā)展過(guò)程中的作用，為探究納米二氧化鈦?zhàn)鳛榄h(huán)境污染物的作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6-GFP小鼠引種于南京醫(yī)科大學(xué)，現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室可自行繁殖。小鼠飼養(yǎng)過(guò)程嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)則飼養(yǎng)?；\具、飲用水及飼料中均不含納米二氧化鈦，可以排除外界環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.1.2 儀器與試劑

動(dòng)物麻醉系統(tǒng)，美國(guó)Microflex公司；石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；光學(xué)顯微鏡及解剖顯微鏡，日本尼康公司。

納米二氧化鈦粉末(5 nm)，碧云天公司；蘇木精、伊紅，美國(guó)Sigma公司；Ki67抗體，美國(guó)Thermo公司；ERα抗體，美國(guó)Santa公司；酒精、福爾馬林、二甲苯溶液和封片劑，美國(guó)Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

將3周齡雌性小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為對(duì)照組(超純水)、納米二氧化鈦低劑量處理組(50 mg·kg-1)和納米二氧化鈦高劑量處理組(250 mg·kg-1)，在相同的時(shí)間點(diǎn)每天灌胃1次，持續(xù)28 d。第29 d小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，并記錄體重。取出小鼠的肝臟和子宮，稱(chēng)重并拍照。取出小鼠乳腺，腹股溝處乳腺用于組織整體染色(WM染色)，胸腺處乳腺固定于福爾馬林溶液中，采用常規(guī)石蠟包埋。

1.2.2 乳腺組織學(xué)定量分析

乳腺導(dǎo)管進(jìn)行病理學(xué)切片和HE染色，觀察到導(dǎo)管的4種形態(tài)，即正常的雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu)為主的乳腺導(dǎo)管、多個(gè)細(xì)胞層增生性病變的導(dǎo)管、非典型腺管增生的導(dǎo)管和發(fā)生原位癌的導(dǎo)管。顯微鏡下對(duì)以上乳腺導(dǎo)管形態(tài)分別進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算增生性導(dǎo)管結(jié)構(gòu)所占比例。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色

將組織切片脫蠟，浸到梯度酒精中進(jìn)行水合，然后放到提前預(yù)熱的抗原修復(fù)液中，15 min后放入封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶中，取出進(jìn)行細(xì)胞透膜，然后敷血清和一抗，過(guò)夜后去掉一抗，敷二抗并染DAB，觀察到棕色后進(jìn)行蘇木精復(fù)染， 然后酒精脫水，最后封片保存。顯微鏡下觀察Ki67和ERα的表達(dá)情況，當(dāng)1個(gè)導(dǎo)管染上棕色的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例大于或等于20%時(shí)，認(rèn)為該導(dǎo)管表達(dá)此抗原。計(jì)算Ki67和ERα表達(dá)導(dǎo)管所占比例。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05時(shí)判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)青春期小鼠肝臟、子宮的影響

肝臟作為外來(lái)藥物代謝的重要器官，它的變化反映藥物毒性的大小。圖1所示，處理組肝臟指數(shù)沒(méi)有顯著變化，表明該劑量納米二氧化鈦對(duì)小鼠未產(chǎn)生顯著的毒性效應(yīng)。子宮作為哺乳動(dòng)物重要的生殖器官，對(duì)乳腺的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組小鼠子宮長(zhǎng)度和寬度均未發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明納米二氧化鈦對(duì)小鼠子宮形態(tài)無(wú)顯著影響。

圖1 小鼠的肝臟指數(shù)與子宮的長(zhǎng)寬度

2.2 對(duì)青春期小鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)的影響

小鼠乳腺導(dǎo)管密度和末端芽數(shù)量見(jiàn)圖2。如圖所示，低劑量處理組小鼠乳腺末端芽數(shù)量較對(duì)照組顯著增加，高劑量處理組乳腺導(dǎo)管密度較對(duì)照組降低。

圖2 小鼠乳腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)

2.3 對(duì)青春期小鼠乳腺病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

正常的乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)由2層細(xì)胞構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)有利于小鼠懷孕時(shí)導(dǎo)管分化為腺泡，便于乳汁的分泌與輸送。當(dāng)乳腺發(fā)生病變時(shí)，出現(xiàn)多層細(xì)胞的增生，懷孕時(shí)導(dǎo)管分化為腺泡和腺泡分泌乳汁的能力降低。如圖3所示，低劑量納米二氧化鈦處理以后，增生性導(dǎo)管的比例有增加的趨勢(shì)，高劑量暴露對(duì)增生性導(dǎo)管的比例沒(méi)有明顯的影響。

圖3 小鼠乳腺組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 對(duì)青春期小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα表達(dá)的影響

對(duì)乳腺導(dǎo)管分別進(jìn)行Ki67和ERα染色，以研究納米二氧化鈦對(duì)乳腺的作用機(jī)制。Ki67是增殖蛋白，處在有絲分裂期的細(xì)胞高表達(dá)Ki67，主要定位在細(xì)胞核中。ERα為雌激素受體，主要表達(dá)在乳腺的管腔干細(xì)胞中，在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有表達(dá)。雌激素與細(xì)胞核上的雌激素受體結(jié)合可引發(fā)基因調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步控制下游基因的轉(zhuǎn)錄。如圖4所示，低劑量納米二氧化鈦暴露顯著增加青春期小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα的表達(dá)。

圖4 小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα的表達(dá)

3 討論

本研究對(duì)C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在青春期時(shí)進(jìn)行納米二氧化鈦暴露，研究發(fā)現(xiàn)，處理組小鼠肝臟指數(shù)、子宮長(zhǎng)度和寬度均較對(duì)照組無(wú)顯著差異。低劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺末端芽的數(shù)量顯著增加，Ki67和ERα的表達(dá)量顯著上升。高劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導(dǎo)管密度降低。

已有納米二氧化鈦的安全性研究結(jié)果不一致，納米二氧化鈦的應(yīng)用是否安全還沒(méi)有明確的結(jié)論。納米二氧化鈦可通過(guò)呼吸道、消化道、皮膚以及注射等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，損傷體內(nèi)組織器官[12]。納米二氧化鈦具有小粒徑效應(yīng)，可通過(guò)簡(jiǎn)單的自由擴(kuò)散和滲透方式進(jìn)入體內(nèi)，透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞乃至核內(nèi)，另外納米二氧化鈦具有高化學(xué)活性，這一特性促使細(xì)胞損傷，從而影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[13-14]。

青春期乳腺導(dǎo)管密度、分支結(jié)構(gòu)、末端芽的數(shù)量和病理學(xué)結(jié)構(gòu)的異常變化是乳腺病變發(fā)展過(guò)程中的重要參考因素[15-16]。本研究結(jié)果顯示，高劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導(dǎo)管變得稀疏，可能是高劑量的納米二氧化鈦抑制了小鼠乳腺的發(fā)育，低劑量沒(méi)有這一作用。青春期小鼠末端芽有促進(jìn)導(dǎo)管分支、延長(zhǎng)的作用[17]，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)低劑量納米二氧化鈦處理后，末端芽顯著增加，說(shuō)明低劑量納米二氧化鈦促進(jìn)了乳腺的異常發(fā)育，但高劑量納米二氧化鈦的暴露對(duì)小鼠乳腺末端芽沒(méi)有明顯的影響。為了探究納米二氧化鈦的作用機(jī)制，對(duì)乳腺導(dǎo)管進(jìn)行了Ki67和ERα染色。青春期小鼠低劑量納米二氧化鈦暴露能夠使乳腺Ki67表達(dá)量顯著增加，Ki67是反映細(xì)胞增殖能力的蛋白標(biāo)志物，可能是納米二氧化鈦損傷乳腺細(xì)胞，機(jī)體為了平衡乳腺代謝，使處于靜止期的乳腺干細(xì)胞進(jìn)行快速增殖。在乳腺癌患者中，雌激素受體表達(dá)量與激素治療是否敏感有關(guān)[18-19]，經(jīng)低劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導(dǎo)管高表達(dá)ERα蛋白。ERα是雌激素信號(hào)通路的下游蛋白，推測(cè)低劑量納米二氧化鈦可能通過(guò)干擾性激素信號(hào)通路影響乳腺的發(fā)育。高劑量納米二氧化鈦處理對(duì)小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα的表達(dá)沒(méi)有顯著的影響，可能因?yàn)楸┞秳┝窟^(guò)高導(dǎo)致機(jī)體反應(yīng)遲鈍。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究納米二氧化鈦對(duì)小鼠乳腺的毒性作用和潛在機(jī)制提供新的依據(jù)和啟示。