劉建和 趙吉銳 雷婁芳 楊成龍 曾 英 王 敏

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南省重點實驗室中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治實驗室，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

近年來，心血管疾病已成為我國人群的主要死亡原因之一[1]，其中急性缺血性心律失常是心血管病極度普遍的臨床表現(xiàn)類型[2]，臨床風險重大，可加重基礎心臟疾病，并能導致心源性猝死。目前，藥物治療仍是缺血性心律失常的主要治療手段，但抗心律失常藥的諸多不良反應始終限制其臨床運用[3]，隨著認識水平的提高，心律失常的治療逐漸以控制原發(fā)病，調(diào)控心臟基本狀況為重點，如保證充足血供、穩(wěn)定血流動力學狀況等比醫(yī)治心律失常自身更為緊要。且藥物研究逐漸由組織器官水平向細胞水平發(fā)展，干細胞移植治療心肌缺血及由此誘發(fā)的心律失常得到了越來越多的關注與研究。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是從骨髓中篩選的已提交心肌譜系的多能成體干細胞，在某些誘導劑作用下可分化成心肌細胞，延緩心臟重構(gòu)，保證細胞的正常功能，促進損傷心肌的修復[4]，這無疑在心律失常的治療中擁有重要的運用前景。柴胡三參膠囊抗心律失常效果明顯[5-8]，且在前期研究中發(fā)現(xiàn)，其能明顯減少缺血性心律失常大鼠心肌中PKA、PKC的表達及血清CRP水平，表明其對心肌急性損傷具有保護作用[9]，此外，柴胡三參膠囊還能明顯減少大鼠心肌細胞HERG K+通道蛋白的失活，減少快速型室性心律失常的出現(xiàn)[10]。本研究旨在通過對柴胡三參膠囊促進BMSCs分化為心肌細胞后p38MAPK、MEF2C及CTnT表達程度影響的研究，佐證柴胡三參膠囊能夠通過促進誘導劑與受體結(jié)合激活p38MAPK信號通路促進BMSCs向心肌細胞的分化從而起到抗心律失常的作用，并為更為深入探討柴胡三參膠囊抗心律失常的信號機制拓寬思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株

P1代骨髓間充質(zhì)干細胞株，購自贏潤生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

健康清潔級 SD 大鼠 20只，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，普通飼料喂養(yǎng)，定期更換墊料，自由攝食，購自天勤動物公司，許可證號：SYXK（湘）2014-0011。

1.3 試藥與儀器

柴胡三參膠囊（由柴胡、法半夏、黃連、黨參、丹參、苦參、青蒿、甘草組成，劑量比例 15∶10∶6∶15∶10∶10∶10∶6，每粒膠囊質(zhì)量為0.4 g）。特級胎牛血清（美國hyclone公司），青、鏈霉素（武漢貝茵萊生物科技有限公司），培養(yǎng)基（美國hyclone公司），水合氯醛（普盛藥業(yè)有限公司），PBS粉（贏潤生物有限公司），DMSO溶解劑（贏潤生物有限公司），MTT試劑盒（福州飛凈生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司），DNA marker I（上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司），BMP-2 粉末包（2 μg）（上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司），0.25%胰酶+0.02%EDTA （美國Sigma公司），Trizol試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司），細胞蛋白裂解液（贏潤生物有限公司），抗體p38MAPK（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），抗體MEF2C（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），抗體CTnT（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），超凈工作臺（SWOJ-1F蘇凈集團安泰公司），離心機（BiofugeStratos德國Thermo公司），恒溫水浴箱（SW2-261-79上海醫(yī)用恒溫設備廠），紫外分析儀（BOT-III北京中儀博騰科技有限公司），電泳儀 （DYY-8C北京六一儀器廠），VDS凝膠成像系統(tǒng) （GIAS-4400北京炳洋科技有限公司），顯微鏡（IX71日本 Olympus公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 含藥血清制備 將大鼠隨機分為柴胡三參膠囊組和空白對照組，每天于8：00和16：00分別灌服柴胡三參膠囊灌胃液及等量生理鹽水，采用連續(xù)7 d予3倍量給藥，依照體表面積3倍量進行計算[11]（按成人70 kg、大鼠200 g體表面積換算：成人等效劑量4.8 g/d，折算為2.4 g/d，2次/d），于末次灌藥1 h后，注射水合氯醛使大鼠處于麻醉狀態(tài)，對大鼠下腹主動脈取血，取血時隨即注入真空采血管，常溫下靜置2 h，待上清液析出，以3000 r/min離心10 min，再用移液槍小心析出上清，即為柴胡三參膠囊含藥血清，再將每組血清調(diào)勻后，放入56℃的水浴箱中滅活30 min，以0.22 μm的微孔濾膜過濾細菌，放于-20℃冰箱中保存以待取用，空白組同上操作分離出不含藥的空白血清。

1.4.2 常規(guī)細胞復蘇、換液、傳代、凍存 取出冷凍管，投入37℃水浴中，搖動凍存管，使其融化；5 min內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積至少10倍；1000 r/min離心5 min；去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞；常規(guī)細胞培養(yǎng)2～3 d后，去舊培養(yǎng)液，用無鈣、鎂的D-Hanks洗滌2次，添入培養(yǎng)液，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；開啟培養(yǎng)房及工作臺，紫外消毒20 min，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，加入2 mL消化液，覆蓋整個細胞界面后吸棄，觀察培養(yǎng)瓶底端出現(xiàn)一層云霧狀，輕敲底部有塊狀物脫落，鏡下可見細胞間隙變大，細胞回縮變圓，少量漂浮后加入10 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打管吹打數(shù)次將細胞懸液吸至離心管，1000 r/min離心5 min吸棄上清，加入PBS吹打混勻，1000 r/min再次離心5 min，丟棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻，按比例接種到細胞培養(yǎng)瓶。當細胞融合約80%～90%時，吸除培養(yǎng)基，用無菌D-Hanks液清洗2次，用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化細胞，消化后吸除胰酶，加入約2 mL培養(yǎng)基吹打混勻細胞，轉(zhuǎn)入到15 mL離心管中，1000 r/min離心5 min，去除上清收集細胞，用凍存液（10%DMSO、90%FBS）重懸細胞，將細胞懸液分裝至凍存管中，每管1 mL，標記細胞種類、凍存日期、細胞傳代數(shù)，采用梯度降溫方法進行細胞凍存：用脫脂棉包裹凍存管，4℃放置 15～30 min，-20 ℃約 1～2 h，-80 ℃保存12 h，最后存入液氮罐中備用。

1.5 檢測指標

1.5.1 MTT法檢測BMSCs增殖 按柴胡三參膠囊含藥血清占培養(yǎng)液的比例分為0%、5%、10%、20%、40%5個濃度組，每組建立6個復孔，應時添加一定MTT溶液及DMSO溶解液，490 nm波長下獲取OD值，確定最佳濃度后，分6、12、24、48 h 4個時段進行觀察，得到最佳時間。

1.5.2 Western blotting法檢測各組細胞內(nèi)p38MAPK mRNA表達 分為空白組、BMP-2+柴胡三參組、BMP-2組、柴胡三參組。以6孔板收集細胞，胰酶消化，按比例加入RIPA和PMSF，冰凍且分裂細胞30 min后，離心5 min，將上清在-20℃條件下分裝凍存。選取0、1、2、4、8、12、16、20 μL 8 個容量將標準液注入 96 孔板的前面8個標準孔中，再在其他的板孔中鋪入10 μL待測樣品，陸續(xù)加入PBS，常溫下靜置30 min。測定蛋白濃度至A560，得出蛋白濃度。按照前期比例調(diào)配濃縮膠，使其高度融合。算出體積，根據(jù)buffer=4∶1的標準均勻混入上樣buffer，逐步加入Marker和待分析樣品，分別以80 V及100 V恒壓進行電泳，量出目的蛋白的長與寬，過濾10 s，置入有10%甲醇的器皿，注入去離子水及電轉(zhuǎn)液。以恒流20 mA轉(zhuǎn)膜，PBS液清洗后置于搖床，完成后于靜置90 min。用相應抗體加入一抗稀釋液，室溫下?lián)u床孵育90 min，以PBS洗滌3次，每次10 min，同上行二抗孵育。標準化將ECL工作液鋪滿膜層表面，安放1～2 min后在凝膠成像系統(tǒng)中查看以及攝像。

1.5.3 RT-PCR法檢測各組細胞內(nèi)MEF2C、CTnT蛋白表達 用胰酶液消化6孔板的細胞收集于EP管中，后以勻漿器勻漿，室溫放置5min并常規(guī)離心15 min。將離心后的均勻液體分層，上層液移至潔凈的試管中，接著注入無雜質(zhì)水連續(xù)吹打后存放于-80℃環(huán)境下。取少量RNA溶液用TE稀釋后，讀取標準的吸收值，A260下讀值為1表示RNA為40 μg/mL。輕彈管底將溶液混合，短暫離心。以70℃干浴3 min，取出靜置待其冷卻，再注入逆轉(zhuǎn)錄酶液0.5 μL，分別以35℃水浴60 min及90℃干浴3 min，用移液槍吸除cDNA（逆轉(zhuǎn)錄終溶液）溶液，存放于-80℃以備用。把樣品中待檢測基因予以即時定量PCR，將全數(shù)cDNA樣品調(diào)配即時定量PCR反應體系。輕彈管底將溶液混合，6000 r/min短暫離心。把已調(diào)配的PCR反應液體置于RT-PCR儀上啟動PCR擴增反應。反應條件為：在93℃條件下預變性2 min，再以93℃ 1 min，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。將目的基因條帶p38MAPK mRNA、MEF2C、CTnT的蛋白與內(nèi)參照的平均吸光度值依次行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

以SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)和單因素方差分析。以P＜0.01為顯著性差異的標準，分析各組產(chǎn)物相對量的情況。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測BMSCs生存率

見表1。經(jīng)柴胡三參膠囊含藥血清干預后，含藥血清濃度在培養(yǎng)液中所占比例為5%、10%、20%、40%時下各時間點OD值均較0%比例濃度下高 （P＜0.01），在20%濃度時達到最大值；以20%濃度在24 h時間節(jié)點下OD值均比其余各組高（P＜0.01），故考慮以20%干預24 h為最佳梯度。

表1 柴三膠囊對干細胞增殖的影響（±s）

表1 柴三膠囊對干細胞增殖的影響（±s）

與本濃度不同時間比較，*P＜0.05；與不同濃度同時間比較，△P＜0.05

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2.2 含藥血清誘導后BMSCs增殖情況

見圖1、2。鏡下可見大量密集的BMSCs懸浮或沉積于培養(yǎng)皿底，PBS緩沖液反復沖洗后可見少量散在分布的貼壁細胞，呈多角短梭形，胞核漿分界清晰，胞核位于胞體膨大部的中央，單核仁居多，胞體可有不規(guī)則突起可見多邊形，無異常突起突出；干預48 h后，反見細胞數(shù)量較24 h干預時減少，細胞密度降低，呈現(xiàn)不同程度的凋亡趨勢。

圖1 24hBMSCs增殖情況（40倍）

圖2 48hBMSCs增殖情況（40倍）

2.3 各組干預后BMSCs中p38MAPK mRNA表達

見表2，圖3。誘導后BMP-2組、BMP-2+柴胡三參組、柴胡三參組p38MAPK表達程度均高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）；BMP-2+柴胡三參組表達水平高于 BMP-2 組、柴胡三參組（P＜0.05）；BMP-2組與柴胡三參組對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。誘導后30 min，BMP-2+柴胡三參組內(nèi)的p38MAPK明顯可見，BMP-2組、柴胡三參組及空白組表達相對較弱。

表2 各組干細胞p38MAPK mRNA表達的影響（±s）

表2 各組干細胞p38MAPK mRNA表達的影響（±s）

與 BMP-2+柴胡三參組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.01。下同

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圖3 各組p38MAPK電泳條帶

2.4 各組干預后心肌基因指標MEF2C、CTnT蛋白的表達

見表3。誘導后BMP-2組、BMP-2+柴胡三參組、柴胡三參組MEF2C表達水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）；BMP-2+柴胡三參組表達水平高于 BMP-2 組、柴胡三參組（P＜0.05）；BMP-2組與柴胡三參組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組誘導后MEF2C、CTnT蛋白表達水平（±s）

表3 各組誘導后MEF2C、CTnT蛋白表達水平（±s）

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3 討 論

在BMSCs向心肌細胞分化過程中，有諸多的信號通路發(fā)揮作用，其中之一便是p38MAPK通路。它參與多類生物細胞過程的調(diào)控，尤其在干細胞的增生繁殖與分化的調(diào)控過程中具有舉足輕重的作用[12]。p38MAPK信號通路在由BMP-2介導的心肌細胞發(fā)育或分化的過程中具有關鍵作用，活化的p38MAPK能夠上調(diào)ATF2、MEF2C等多種轉(zhuǎn)錄因子的表達，而這兩種轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到許多基因啟動子區(qū)AP-1位點，增加其轉(zhuǎn)錄活性，影響細胞的增殖、分化，以激活下游基因或蛋白如CTnT、MEF2C等的表達，達到向心肌細胞分化的目的[13]。

缺血性心律失常是由于心肌缺血引起心肌細胞壞死抑或凋亡，無法達到心肌修復要求進而出現(xiàn)數(shù)量減少，導致電活動形成及傳導均反常。缺血引發(fā)心臟中擁有正常舒縮效應的心肌細胞數(shù)目下降，心功能減退。以往的觀念表明心臟不具有再生以及自我修復的功能，也無法進行自我更新，只能依靠纖維瘢痕組織修復或未受損心肌細胞肥大來進行代償[14]。目前，干細胞移植治療缺血性心律失常已成為研究的熱點。而BMSCs容易取材，對人體損害甚微，而且可以進行定向分化，并且方便著床，缺血條件對其無明顯影響，自身細胞移植也未見明顯排異現(xiàn)象等。以上特性使BMSCs移植具有天然優(yōu)勢，成為干細胞移植主要的種子細胞[15-16]。本研究顯示，柴胡三參膠囊含藥血清作用后，BMSCs大量增殖且在24 h達到最大值，與誘導劑合用后細胞內(nèi)的p38MAPK、MEF2C及CTnT表達明顯升高，可見柴胡三參膠囊能夠促進誘導劑與其受體相結(jié)合，促進BMSCs向心肌細胞的分化。因此，在干細胞移植治療前以柴胡三參膠囊對誘導因素進行預處理，能夠明顯增強BMSCs的分化能力，提高心肌修復效率。更加細致的研究P38MAPK信號通路在BMSCs分化中的作用，對于揭示BMSCs分化的機制及為臨床采用干細胞移植治療缺血性心律失常尋找更加高效的方法具有重要價值。