李亞俊，顧曉靜，楊樂，邊虹

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 1.消化內(nèi)科，2.胸外科，寧夏 銀川 750004）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是一種常見的消化道腫瘤，在我國的發(fā)病率較高[1]。由于其具有局部侵襲浸潤、早期轉(zhuǎn)移等特點，往往預(yù)后不佳，生存率較低。通過對ESCC生物學(xué)標(biāo)志物及信號通路的研究，可以預(yù)測腫瘤的預(yù)后，指導(dǎo)治療方案，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療，從而提高ESCC的生存率。

微小RNA（microRNA）是一類非編碼功能的單鏈RNA，長度約17～25個核苷酸。microRNA參與包括細胞增殖、凋亡、遷移及分化等多種病理生理過程，并且參與腫瘤信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[2]。MicroRNA-1469（miR-1469）系microRNA家族中的一員，位于15號染色體，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[3]，miR-1469在多種腫瘤組織中異常表達，具體表現(xiàn)為在凋亡的腫瘤細胞中，miR-1469的表達水平顯著提高。目前已有文獻報道m(xù)icroRNA在ESCC中的作用[4]，但miR-1469與ESCC的關(guān)系尚無相關(guān)報道。本研究選擇miR-1469，首先研究其在ESCC中的表達情況，并觀察其在ESCC進展及預(yù)后中所起到的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年6月-2010年6月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院初次診斷為ESCC的患者98例。入選標(biāo)準(zhǔn)為：①均行食管癌根治手術(shù)；②術(shù)前未行放化療；③未有圍手術(shù)期死亡；④臨床病理與隨訪資料完整。所有的腫瘤組織及腫瘤旁正常食管組織于術(shù)后儲存于液氮中，病理結(jié)果經(jīng)病理科兩名醫(yī)生確認(rèn)。TNM分期采用UICC/AJCC 2009第7版標(biāo)準(zhǔn)。

所有患者隨訪內(nèi)容包括體格檢查、上消化道造影、胸腹部CT以及胃鏡等，隨訪間隔時間為3～6個月，隨訪時間至患者死亡或本研究的截止日期（2015年6月）。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)說明書使用Trizol裂解液從冷凍組織中提起總RNA，然后通過U-3010紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度。然后依據(jù)上海生工RNA PCR-Kit試劑說明書進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測基因表達水平。采用IQ5 software分析實驗結(jié)果，計算Ct值。使用內(nèi)參基因GAPDH的Ct值校正目的基因Ct值，得到△Ct值。比較處理組和對照組的△Ct值得到△△Ct值?；虮磉_量比值（處理組/對照組）=2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以例表示，比較用χ2檢驗，Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗生存曲線的統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1469在ESCC中的表達情況

比較miR-1469在ESCC及癌旁正常組織中的表達情況，如果ESCC中的miR-1469的表達量低于癌旁正常組織，系miR-1469的低表達，反之，為miR-1469的高表達。結(jié)果顯示（見圖1），miR-1469低表達組共42例，表達量為（2.51±0.73），miR-1469高表達組共56例，表達量為（6.27±1.08），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-19.457，P=0.000）。

圖1 miR-1469在ESCC中的表達

2.2 miR-1469表達與臨床病理特征的關(guān)系

miR-1469表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及病理分期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.704、24.000和53.844，P=0.033、0.000和0.000），而與年齡、性別、腫瘤直徑和分化程度，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.056、1.224、2.046和5.125，P=0.813、0.269、0.193和0.076）。見附表。

2.3 miR-1469表達與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系

共有65例患者出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其5年無瘤生存率為32.6%，其中38例為miR-1469低表達，27例為miR-1469高表達，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.040，P=0.008），提示miR-1469低表達組的腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率高于高表達組。低表達miR-1469的患者5年無瘤生存率低于高表達miR-1469的患者（17.9% vs 42.8%，P=0.004）。見圖2。

附表 miR-1469的表達與臨床病理特征的關(guān)系 例

圖2 患者5年總無瘤生存率

2.4 miR-1469的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

分析miR-1469的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在N0患者中，miR-1469低表達者共9例，在N1～3患者中，miR-1469低表達者共33例，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.000，P=0.000）。在N1～3的患者中，低表達miR-1469組的5年無瘤生存率低于高表達組（7.3% vs 31.5%，P=0.043）。見圖3。

2.5 miR-1469的表達與預(yù)后的關(guān)系

在98例患者中，56例在隨訪期間內(nèi)死亡，5年總生存率為39.5%。低表達miR-1469組的5年總生存率低于高表達組（29.3% vs 47.1%，P=0.027）。見圖4。

圖3 N0及N1～3患者的5年無瘤生存率

圖4 患者5年總生存率

3 討論

作為一種常見的消化道惡性腫瘤，食管癌具有較高的死亡率，多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)的時候腫瘤就已經(jīng)侵透食管外膜或已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，并且預(yù)后不佳[5]。目前國際上通用的分期標(biāo)準(zhǔn)為TNM分期，根據(jù)此分期來判斷患者的病程及預(yù)后，但是TNM分期能不能準(zhǔn)確地判斷病情的轉(zhuǎn)歸尚存在爭議，越來越多的研究關(guān)注于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的個數(shù)[6]。在ESCC患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者更容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，更多的學(xué)者認(rèn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移系獨立的預(yù)后因素[7]。microRNA富含RNA，其序列大小約為17～25個核苷酸，在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移和分化等生理及病理過程中起到了關(guān)鍵的作用[8]，并且參與腫瘤信號通路的過度激活或者過度抑制，在腫瘤的臨床診療中，能夠指導(dǎo)分型及預(yù)后[9]。作為microRNA中的一員，miR-1469位于15號染色體，具有致癌基因或抑癌基因的活性[10]，參與了腫瘤的進程中。miR-1469在腫瘤組織中異常表達，具體表現(xiàn)為在凋亡瘤細胞中，miR-1469的表達水平提高。XU等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌中，miR-1469能夠增強VP16所誘導(dǎo)的細胞凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)stat5a系miR-1469作用的靶點，miR-1469通過stat5a調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增生和凋亡。關(guān)于stat與食管癌的關(guān)系已有大量的文獻闡述，而miR-1469、stat5a及食管癌3者之間的關(guān)系尚未有相關(guān)研究。因此，本研究選擇miR-1469，首先研究其在ESCC中的表達情況，并觀察其在ESCC進展及預(yù)后中所起到的作用。本研究系統(tǒng)分析98例ESCC患者標(biāo)本中miR-1469的表達以及與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-1469的表達水平與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義，具體表現(xiàn)為在T1、N0及Ⅰ期患者中，miR-1469多呈現(xiàn)高表達，在中晚期患者中多為低表達，這提示miR-1469的表達水平與ESCC的進程密切相關(guān)，miR-1469的表達水平能夠協(xié)助判斷腫瘤的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

miR-1469的表達水平與5年無瘤生存率和總生存率密切相關(guān)，低表達miR-1469的ESCC患者，其5年無瘤生存率和總生存率均低于高表達者。進一步地分析發(fā)現(xiàn)，在N0患者中，miR-1469表達水平的高低與5年無瘤生存率無相關(guān)，但在N1～3患者中，其5年無瘤生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這提示在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，miR-1469低表達者更容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-1469的表達與ESCC的病理分期及預(yù)后具有密切的關(guān)系，miR-1469低表達患者更容易出現(xiàn)ESCC的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差，與既往的文獻[3]關(guān)于miR-1469對于人類腫瘤的抑制作用的報道具有一致性。但是miR-1469對ESCC的抑制作用需要進一步的體外細胞實驗加以驗證，其作用靶點及信號通路需進一步明確。這將對于實現(xiàn)ESCC的精準(zhǔn)治療具有重大的意義。