韓瑩，楊文秀，濮珍紅，萬瓏

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004）

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是成人最常見的非霍奇金淋巴瘤，其發(fā)病占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。由于分子遺傳學(xué)、臨床過程和預(yù)后、形態(tài)學(xué)及免疫表型等方面的差異，DLBCL是一組異質(zhì)性的淋巴瘤。目前，利妥昔單抗+CHOP方案為DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，只能使50%的患者得到持續(xù)緩解，約45%患者則表現(xiàn)出原發(fā)耐藥和緩解后復(fù)發(fā)[2]。腫瘤的臨床分期、國際預(yù)后指數(shù)（international prognosis index, IPI）和增殖活性等是惡性腫瘤常用的預(yù)后評估因素，DLBCL的遺傳學(xué)改變和腫瘤細(xì)胞的免疫表型對其臨床預(yù)后和治療效果有明顯影響，但發(fā)現(xiàn)IPI同分值的DLBCL患者預(yù)后差異較大[3]。因此，尋找DLBCL的新型預(yù)后評估因素很有意義。MiRNA是非編碼調(diào)控型RNA分子，可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展及臨床進(jìn)程。MicroRNA-125a（miR-125a）在DLBCL細(xì)胞群中能靶向抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3基因（the tumor necrosis factor,alpha-induced protein 3 gene, TNFAIP3, A20），進(jìn)而激活NF-κB通路而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，腫瘤的侵襲性和耐藥性等[4-6]。有研究證明[7]，多藥耐藥基因1（multi-drugs resistance gene, MDR1）啟動子上存在一個NF-κB結(jié)合位點，同時在預(yù)后不良的DLBCL患者中miR-125b表達(dá)上調(diào)。據(jù)此，本研究通過檢測DLBCL患者腫瘤組織中miR-125a-5p的mRNA水平以及P糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）表達(dá)、細(xì)胞增殖核抗原（nuclcar-associated antigen, Ki-67）蛋白表達(dá)對預(yù)后的影響，探討miR-125a-5p表達(dá)在DLBCL臨床過程和預(yù)后評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2006年1月-2016年12月于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科診斷的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者和檔案石蠟標(biāo)本，按照WHO 2016年淋巴瘤分類更新的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出非特指的DLBCL患者，將腫瘤組織大小超過0.5 cm直徑的90例DLBCL納入研究（DLBCL組），并以8例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者作為研究對照（對照組）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器P-gp單克隆抗體（英國Abcam公司），Ki67單抗、二抗及其他免疫組織化學(xué)檢測試劑（北京中杉金橋公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），DEPC水（日本Sigma公司），miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Gene Copoeia公司）。紫外分光光度計（Nano Drop1000，美國Thermo Sciencific公司），CFX Connect Real-time PCR檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2.2 蘇木素-伊紅染色 按照常規(guī)病理操作規(guī)范進(jìn)行[8-9]。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 采用PV二步法，以枸櫞酸鹽（pH=6.0）進(jìn)行高壓熱修復(fù)。一抗稀釋度：P-gp單克隆抗體1∶50，Ki67單抗1∶100。二抗及其他免疫組織化學(xué)檢測試劑遵循實驗步驟，按照說明書依次添加。P-gp陽性對照為心肌組織，Ki67陽性對照為反應(yīng)性增生淋巴結(jié)，空白對照以0.01 mol PBS（pH=7.2）代替一抗。

判讀標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選擇10個高倍鏡視野（×400）計數(shù)1 000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取10個高倍鏡視野均數(shù)為其陽性率。P-gp陽性信號定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，以腫瘤細(xì)胞陽性率＞20%為陽性，＜20%為陰性。

1.2.4 miR-125a-5p檢測 ①總RNA提?。菏灲M織切片、脫蠟、組織消化，采用Trizol試劑盒提取DLBCL及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生石蠟組織的總RNA，將提取的總RNA溶解至0.1%的DEPC水中，采用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，在260～280 nm波長范圍檢測光密度值，控制在1.8～2.0之間以滿足檢測所需RNA質(zhì)量；②RNA逆轉(zhuǎn)錄：將模板總RNA置于冰上溶解，采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照說明書操作。在冰上配制反應(yīng)體系：1 μl 205 u/μl poly A polymerase、1 μl RTase Mix、5 μl 5×PAP/RT Buffer、不同體積總RNA，以ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系，總體積達(dá)到25 μl。輕柔混勻，12 000 r/min離心2 min后將反應(yīng)液置于PCR儀，37℃孵育60 min，然后85℃孵育5 min終止反應(yīng)，置入4℃保存；③實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）：選用All-in-OneTMmiRNA qPCR Mix試劑盒，內(nèi)參基因選用U6，按照試劑盒說明書操作。內(nèi)參U6引物和目的has-miR-125a-5p引物購自美國Gene Copoeia公司，嚴(yán)格遵照試劑盒操作說明書，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，于八聯(lián)管中配制反應(yīng)體系 ：10 μl All-in-One qPCR Mix、2 μl All-in-oneTMmiRNA qPCR Primer、2 μl Universal Adaptor PCR Primer、2 μl cDNA、4 μl ddH2O，總體積達(dá)20 μl；輕柔混勻，12 000 r/min離心2 min，CFX Connect real-time PCR檢測系統(tǒng)中進(jìn)行，設(shè)置反應(yīng)程序：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃（收集熒光信號）10 s 45個循環(huán)，95℃ 10 s，熔解曲線溫度：65～95℃，每5秒升高0.5℃；④分析每個樣本的Ct值，以U6作為內(nèi)參，由公式2-ΔΔCt計算miR-125a-5p的相對表達(dá)量。ΔCt=miR-125a-5p Ct平均值-U6 Ct平均值，ΔΔCt=DLBCL組ΔCt-對照組ΔCt。以2-ΔΔCt中位數(shù)作為分界值，將DLBCL患者組分為miR-125a-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 隨訪

主要采用電話隨訪、門診及住院病例復(fù)查及信訪。隨訪開始時間為首次明確病理診斷，隨訪截止時間為2016年12月31日，總生存期（overall survival,OS）時間計算從診斷確立到DLBCL引起的死亡或隨訪終止，無復(fù)發(fā)生存期（relapse free survival,RFS）時間計算從診斷確立到DLBCL復(fù)發(fā)、死亡或隨訪終止，與本病不相關(guān)的死亡算為截尾。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，兩組間獨立樣本采用Mann-WhitneyU檢驗，miR-125a-5p表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)統(tǒng)計采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗，采用COX風(fēng)險比例模型對各個協(xié)變量進(jìn)行效應(yīng)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

90例DLBCL中，男性55例，女性35例，男女比為1.6∶1.0；發(fā)病年齡20～85歲，中位年齡64歲；原發(fā)于淋巴結(jié)內(nèi)41例，淋巴結(jié)外49例；non-GCB DLBCL型64例，GCB-DLBCL型26例；Ann Arbor臨床分期Ⅰ期27例，Ⅱ期33例，Ⅲ期6例，Ⅳ期24例；乳酸脫氫酶（LDH） 109～245 u/L 68例，＜245 u/L 22例；IPI評分0～1分25例，2分32例，3分26例，4～5分7例。

2.2 miR-125a-5p在DLBCL組和對照組中的表達(dá)

在DLBCL組和對照組中miR-125a-5p表達(dá)量分別為3.532（0.230，10.960）和1.015（0.340，2.540），與對照組比較，miR-125a-5p在DLBCL組中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（U=113.00，P=0.001），見圖1。

圖1 兩組miR-125a-5p相對表達(dá)量

2.3 miR-125a-5p表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)miR-125a-5p的表達(dá)水平，以中位數(shù)值為界，將90例DLBCL患者分為miR-125a-5p高表達(dá)組（n=47）、miR-125a-5p低表達(dá)組（n=43）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p的表達(dá)在正常LDH與LDH升高患者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.427，P=0.020），在GCB與non-GCB患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.744，P=0.009），而在不同年齡（＜60歲 vs ＞60歲）、性別、原發(fā)部位、Ann Arbor臨床分期和IPI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.4 miR-125a-5p表達(dá)對P-gp蛋白表達(dá)的影響

在miR-125a-5p高表達(dá)組中P-gp蛋白陽性表達(dá)率為61.7%（29/47），而低表達(dá)組P-gp蛋白陽性率為39.5%（17/43），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且高表達(dá)組高于低表達(dá)組。見圖2和表2。

表1 DLBCL患者中miR-125a-5p表達(dá)與臨床病理相關(guān)性

圖2 DLBCL中P-gp表達(dá)情況 （PV×400）

表2 miR-125a-5p與P-gp的表達(dá) 例

2.5 miR-125a-5p表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響

圖3 兩組生存曲線圖

圖4 兩組生存曲線圖

在90例DLBCL患者中，完整隨訪資料的有51例，隨訪率達(dá)到56.7%，隨訪時間0.5～120.5個月（中位隨訪時間58個月）。本研究以51例患者miR-125a-5p表達(dá)水平的中位數(shù)值為界，分為miR-125a-5p的mRNA的高表達(dá)組和低表達(dá)組，Kaplan-Meier及Log-rank檢驗分析結(jié)果顯示，miR-125a-5p低表達(dá)組的中位生存時間65個月高于高表達(dá)組34個月，低表達(dá)組中位無復(fù)發(fā)生存時間60個月高于高表達(dá)組36個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3、4）。單因素COX回歸分析顯示：Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期、miR-125a-5p高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)；多因素COX風(fēng)險模型分析顯示，Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期和miR-125a-5p高表達(dá)均可作為DLBCL患者評估預(yù)后的因素（見表3、4）。

表3 總生存期單因素COX風(fēng)險模型回歸分析

表4 總生存期多因素COX風(fēng)險模型回歸分析

3 討論

DLBCL是一組生長迅速、侵襲性高、預(yù)后具有高度異質(zhì)性的惡性非霍奇金淋巴瘤。近年來，IPI評分已經(jīng)成為評價DLBCL患者預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)，盡管IPI評分能夠預(yù)測某些特定免疫亞型患者的病情進(jìn)展，但是對于患病早期就需要了解病情變化以便進(jìn)行早期治療的患者卻受到很多限制[10-11]。根據(jù)基因表達(dá)譜分型發(fā)現(xiàn)，相對non-GCB DLBCL、GCB-DLBCL患者有更好的預(yù)后，但是檢測價格過于昂貴不利于臨床上廣泛應(yīng)用和開展[12]。因此，對于能夠真正指導(dǎo)個體化治療和影響臨床進(jìn)程的指標(biāo)，需要進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)。

miRNA分子在轉(zhuǎn)錄后水平作用于靶標(biāo)mRNA，調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡及耐藥等生物學(xué)特征，同時作為抑癌基因或者癌基因影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展[13]。多種miRNA分子在DLBCL中都有異常表達(dá)，其表達(dá)水平直接影響DLBCL的預(yù)后。LAWRIE等[14]曾經(jīng)分析80例DLBCL患者中464種不同miRNA分子，發(fā)現(xiàn)miRNA能夠相對準(zhǔn)確地預(yù)測淋巴瘤的分型，有效地表明miRNA與淋巴瘤分化之間存在著密切的關(guān)系，為疾病早期診斷提供依據(jù)。miR-125家族包括miR-125a和miR-125b，WANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-125b的DLBCL患者預(yù)示復(fù)發(fā)、不良預(yù)后，它的失調(diào)先于臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)和影像學(xué)診斷，可作為評價治療效果的新型預(yù)后靶向分子。

有報道認(rèn)為[16-17]，早期非小肺癌患者和肺癌細(xì)胞株中miR-125a-5p的表達(dá)量降低，在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平可影響P53的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。目前，miR-125a在DLBCL中的表達(dá)及其在藥物抵抗和風(fēng)險評估等方面中的作用少見報道。

NF-κB通路是本課題組研究DLBCL的發(fā)生、耐藥及預(yù)后等臨床進(jìn)程中涉及的最重要的通路，A20基因TNFAIP3，是一個新的腫瘤抑制基因，它編碼的A20蛋白是一種具有雙重功能的鋅指蛋白，它通過裂解MALT1泛素鏈（一種NFκB活化相關(guān)因子）或通過抑制IκB的磷酸化而抑制NFκB的活化[18]。國內(nèi)外和本課題組前期的研究都發(fā)現(xiàn)，部分DLBCL中存在A20基因的缺失突變、錯義突變和甲基化，且ABCDLBCL中A20甲基化發(fā)生率高于GCB-DLBCL，還發(fā)現(xiàn)A20的突變和甲基化與NF-κB活化及其下游靶基因MDR1編碼的P-gp蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，A20突變的DLBCL中MDR1編碼的產(chǎn)物P-gp蛋白表達(dá)增多[19]。有研究報道[4]A20基因是miR-125a和miR-125b的直接靶標(biāo)，后兩者經(jīng)常在DLBCL中獲得和/或過表達(dá)，這種異常表達(dá)抑制A20而導(dǎo)致NF-κB異?；罨?。本研究通過檢測DLBCL腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，DLBCL中miR-125a-5p的表達(dá)水平升高，且miR-125a-5p與腫瘤免疫表型之間存在相關(guān)性，推測miR-125a-5p在DLBCL中的上調(diào)表達(dá)也通過抑制A20的表達(dá)而促進(jìn)NFκB的活化，異?；罨腘Fκ-B通過調(diào)節(jié)其下游靶基因而影響DLBCL的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，90例非特指DLBCL病例中，miR-125a-5p上調(diào)表達(dá)病例的耐藥蛋白P-gp的表達(dá)明顯升高，推測這可能是miR-125a-5p抑制A20表達(dá)而間接活化NF-κB的結(jié)果，并可能與DLBCL耐藥有關(guān)。

近年來，在CHOP方案和利妥昔單抗+CHOP方案治療DLBCL過程中，miRNA分子所發(fā)揮的預(yù)后潛在診斷價值越來越受到關(guān)注[20-21]，本研究通過追蹤51例DLBCL患者10年以上的生存及復(fù)發(fā)等情況，以miR-125a-5p表達(dá)的中位數(shù)為閾值，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組患者的OS和RFS均低于低表達(dá)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；單因素及多因素COX生存分析：患者的性別、年齡、免疫分型、原發(fā)部位、LDH、IPI評分及Ki67表達(dá)高低均與DLBCL預(yù)后沒有相關(guān)性，而高表達(dá)miR-125a-5p、Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ可作為預(yù)后危險指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p表達(dá)與Ann Arbor臨床分期不存在相關(guān)性，而兩者均與不良預(yù)后相關(guān)可能原因是，淋巴瘤Ann Arbor分期是按照病變累及的部位和范圍進(jìn)行劃分，miR-125a-5p表達(dá)與DLBCL累及的部位和范圍無相關(guān)，而它們對預(yù)后的影響可能分別各自存在著一定的機(jī)制和原因，等待進(jìn)一步去探索和發(fā)現(xiàn)。同本實驗結(jié)果不同的是，黃然欣等[22]發(fā)現(xiàn)，血清LDH水平可影響非霍奇金淋巴瘤（NHL）預(yù)后，正常血清LDH組比高LDH組藥物治療的有效率高。有研究發(fā)現(xiàn)[23]，將miRNA分子與IPI結(jié)合來建立存活率模型進(jìn)行腫瘤的臨床結(jié)局評判會比單個模型更有利，而本實驗中并未發(fā)現(xiàn)IPI評分與DLBCL患者預(yù)后存在相關(guān)性，聯(lián)合評判到底取決于miRNA分子類別，還是與miRNA與IPI評分之間建立的關(guān)系模型有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-125a-5p在DLBCL中發(fā)揮著類似癌基因的作用，且可能靶向作用于A20基因，活化NF-κB通路介導(dǎo)MDR1/P-gp途徑，使患者對化療藥物產(chǎn)生抵抗影響預(yù)后，同時miR-125a-5p可作為評判DLBCL預(yù)后的分子標(biāo)志物，未來的實驗研究可一步步證實該結(jié)果的可靠性。