荊凌華，劉松年，馬利敏，楊海平

（河南科技大學第一附屬醫(yī)院 血液科，河南 洛陽 471023）

慢性粒細胞白血?。╟hronic myelocytic leukemia,CML）是一種起源于造血干細胞的惡性增殖性疾病，以t（9∶22）（q34∶q11）染色體易位形成的BCRABL融合基因為主要特征，該基因編碼的BCR-ABL融合蛋白可以持續(xù)性活化酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）伊馬替尼作為首個上市的分子靶向藥物，能夠抑制BCR-ABL蛋白激酶，在CML的靶向治療方面取得很好的效果。然而隨著臨床的廣泛應(yīng)用，部分患者出現(xiàn)耐藥性。伊馬替尼耐藥性是由多種機制引起的，其中BCR-ABL激酶的點突變是最常見的耐藥機制[1-2]。第2代TKIs尼洛替尼和達沙替尼等能夠克服大部分突變體產(chǎn)生的耐藥性，但對T315I突變型BCR-ABL激酶引起的耐藥無效，已有多項研究表明，尼洛替尼能夠安全有效地治療伊馬替尼耐藥或不耐受的CML患者，表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景[3-5]。本研究從基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus, GEO）中下載尼洛替尼和伊馬替尼處理后CML細胞的基因表達譜數(shù)據(jù)，篩選出因TKIs處理而改變的差異基因并進行生物信息學挖掘，闡明TKIs對CML基因表達和功能的影響以及分子機制，為白血病的靶向治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從在線GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE19567數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由Bruennert D和Neumann F提交，包含12個樣品的表達譜芯片數(shù)據(jù)（GSM487683-GSM487694）。實驗設(shè)計方案為CML細胞系K562以0.05 μmol尼洛替尼或0.50 μmol伊馬替尼處理24 h，對照組以DMSO處理，分別提取處理后K562細胞的總RNA，采用GPL571檢測平臺，即Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array進行芯片檢測，各有4個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 差異表達基因篩選 將下載的GSE19567數(shù)據(jù)集CEL文件輸入BRB-ArrayTools軟件，進行基因芯片信號值的預處理、標準化和過濾，然后采用SAM方法統(tǒng)計各個樣品中每個基因的顯著水平P值和誤判率Q值，篩選差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs）的標準為P＜0.05，Q＜0.05，差異倍數(shù)≥2倍。同時計算基因與樣本間的相關(guān)性，按照先基因、后樣本的順序?qū)EGs表達數(shù)據(jù)進行層次聚類分析，連接方法為Average Link。

1.2.2 GO功能富集分析 基因本體（gene ontology,GO）是標準化的基因功能分類體系，包括細胞組分、分子功能和生物過程3個類別。本研究把篩選的DEGs向GO數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/）映射，計算每個GO條目映射到的差異基因數(shù)目，采用Fisher檢驗統(tǒng)計GO富集的概率值，并用Benjamini-Hochberg法進行調(diào)整以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR），顯著富集GO條目的標準為P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05。

1.2.3 KEGG通路富集分析 KEGG數(shù)據(jù)庫有助于把基因及其表達情況以整體網(wǎng)絡(luò)形式進行全面研究，能夠從大規(guī)模分子水平信息注解生物系統(tǒng)的高級功能。本研究基于KEGG數(shù)據(jù)庫，采用Fisher精確檢驗統(tǒng)計DEGs在Pathway中的富集程度，P＜0.05和FDR＜0.05的pathway定義為顯著富集的pathway。

1.2.4 互作網(wǎng)絡(luò)分析 基于KEGG數(shù)據(jù)庫中基因表達產(chǎn)物之間的相互作用，在Pathway數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索DEGs的正向和反向基因，再依據(jù)差異基因與其正反向作用關(guān)系描繪基因間的連接線，圓圈表示基因，線段表示相互作用，從而構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)。以Pathway為單位，利用圖論的方法將顯著富集的Pathway根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中的相互關(guān)系構(gòu)建pathway互作網(wǎng)絡(luò)，進而分析顯著性Pathway之間的傳導關(guān)系[6]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果

下載GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE19567數(shù)據(jù)集，以DMSO處理的K562細胞為對照組，尼洛替尼或伊馬替尼處理的K562細胞為實驗組，根據(jù)篩選標準，從尼洛替尼處理的CML細胞表達譜芯片數(shù)據(jù)中篩選出1 517個DEGs，包括上調(diào)基因328個，下調(diào)基因1 189個，層次聚類圖見圖1；從伊馬替尼處理的CML細胞表達譜數(shù)據(jù)中篩選出692個DEGs，包括上調(diào)基因250個，下調(diào)基因442個，層次聚類圖見圖2。取交集后共得到519個DGEs，包括上調(diào)基因177個，下調(diào)基因342個，部分差異基因見表1。

2.2 GO功能富集分析

圖1 尼洛替尼影響的差異基因聚類分析

圖2 伊馬替尼影響的差異基因聚類分析

表1 部分差異表達基因列表

將篩選出的DEGs進行GO功能注釋后發(fā)現(xiàn)，顯著富集的生物過程類別共264個GO條目，主要涉及小分子代謝、血液凝固、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖與凋亡調(diào)控等；顯著富集的分子功能類別共80個GO條目，主要集中在蛋白結(jié)合、蛋白二聚化活性、序列特異性DNA結(jié)合和ATP結(jié)合等。GO富集分析中生物過程類別和分子功能類別富集水平最顯著的前10個GO條目見表2、3。

2.3 KEGG通路富集分析

以KEGG數(shù)據(jù)庫中的Pathway為單位，將篩選出的DEGs向整個背景基因組映射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)代謝通路、氨基酸合成、PI3K-Akt通路和Jak-STAT通路等60個Pathway顯著富集，其中富集水平最顯著的前10個Pathway見表4。

表2 差異基因GO富集分析（生物過程類別）

表3 差異基因GO富集分析（分子功能類別）

表4 差異基因pathway富集分析

2.4 互作網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系而構(gòu)建的基因互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，圓點為差異基因，連線表示2個差異基因間的作用關(guān)系。圓點的大小代表betweenness值，圓點越大，表明該差異基因在互作網(wǎng)絡(luò)中越重要，網(wǎng)絡(luò)中的核心基因包括SHMT2（betweenness=142）、CBS（betweenness=108）、CTH（betweenness=108）、HK2（betweenness=64）。 基 于KEGG數(shù)據(jù)庫中信號通路的正反向關(guān)系，構(gòu)建pathway之間的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），圓點表示通路，帶箭頭的實線表示兩個通路之間的上下游關(guān)系。圓點大小代表degree值，圓點越大，表明與之有正反向關(guān)系的通路數(shù)目越多，在網(wǎng)絡(luò)中的作用也越重要，核心pathway包括MAPK信號通路（degree=18）、細胞凋亡（degree=15）、細胞周期（degree=14）和腫瘤通路（degree=14），其中腫瘤通路是上游調(diào)控通路，MAPK信號通路、細胞凋亡和細胞周期主要作為反向效應(yīng)通路。

圖3 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 Pathway相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

BCR-ABL激酶能夠活化PI3K、Ras、Jak-STAT等信號通路，干擾正常的細胞周期和增殖分化，促進白血病的發(fā)生和發(fā)展。伊馬替尼高度特異地占據(jù)BCRABL激酶非活化構(gòu)象上的ATP結(jié)合位點，阻礙ATP的鳥嘌呤與BCR-ABL結(jié)合和ATP磷酸化，進而顯著抑制ABL酪氨酸激酶的催化活性，特異地抑制BCR-ABL細胞的增殖。以甲基咪唑環(huán)置換伊馬替尼的N-甲基哌嗪基團，并在苯環(huán)上連接三氟甲基，得到新型高親和力ATP競爭性抑制劑尼洛替尼。尼洛替尼也是結(jié)合非活化構(gòu)象的ABL激酶，使P-環(huán)折疊覆蓋ATP結(jié)合位點，形成BCR-ABL激酶的無活性構(gòu)象[7]。有研究表明，伊馬替尼和尼洛替尼也能夠有效抑制血小板衍化生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）和c-Kit受體的酪氨酸激酶[8-9]。BCR-ABL激酶抑制劑從單靶點發(fā)展至多靶點，不斷提高其有效性和選擇性，以克服各種突變型激酶引起的耐藥。

為進一步探索尼洛替尼與伊馬替尼在治療CML時對基因表達和功能的影響，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE19567數(shù)據(jù)集，對TKIs處理后CML細胞的表達譜進行分析，共篩選出519個差異基因。GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)該差異基因主要涉及小分子代謝、血液凝固、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖與凋亡調(diào)控等生物學過程，主要參與代謝通路、氨基酸合成、PI3K-Akt通路和Jak-STAT通路等Pathway?；蚧プ骶W(wǎng)絡(luò)分析篩選的核心基因包括SHMT2、CBS、CTH、HK2，MAPK信號通路、細胞凋亡、細胞周期和腫瘤通路等核心Pathway在Pathway互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮主要作用，該基因和通路可能是TKIs抑制白血病的潛在靶點。SHMT2基因編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2，主要催化甘氨酸合成，也參與一碳代謝、細胞增殖調(diào)控等過程。CBS基因編碼胱硫醚β合酶，涉及同型半胱氨酸、胱氨酸、絲氨酸等氨基酸代謝過程。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，CBS表達水平與巨核細胞白血病中成髓細胞對阿糖胞苷的敏感性密切相關(guān)。胱硫醚-γ-裂解酶CTH催化胱硫醚轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼幔婕昂虬被岽x、促進NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性、抑制凋亡信號通路等過程。HK2在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、缺血反應(yīng)、凋亡線粒體改變、線粒體膜滲透性調(diào)控等過程發(fā)揮作用，在急性髓系白血病FLT3/ITD突變通過上調(diào)線粒體中HK2的表達引起有氧糖酵解增加，使得白血病細胞高度依賴于糖酵解；另外三氧化二砷能夠抑制HK2，而HK2的過表達減少三氧化二砷所誘導細胞凋亡[11-13]。TKIs處理后CML細胞中SHMT2、CBS、CTH、HK2等基因表達下調(diào)，引起代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路變化，活化MAPK、Jak-STAT信號通路，阻滯細胞周期，最終抑制白血病細胞的增殖和誘導其發(fā)生凋亡。

總之，TKIs影響CML細胞代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路的相關(guān)基因，通過激活MAPK通路、細胞周期阻滯和誘導凋亡等分子機制抑制白血病，為白血病的分子靶向治療提供基礎(chǔ)，對設(shè)計和開發(fā)新型BCR-ABL激酶抑制劑也提供有價值的指導。