張庭秀，馬李杰，范賢明，肖貞良

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 成都 610083）

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各系統(tǒng)腫瘤中均居首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌病例的85%以上，是肺癌中最常見的類型[1]，且NSCLC發(fā)病機制復(fù)雜，尚無根治療法。目前，NSCLC的臨床治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等，均取得了一定療效。但NSCLC 5年生存率仍低于15%[2]，且很多患者不能耐受放化療帶來的毒副作用，同時對靶向藥物產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。中藥多取自于各種天然物質(zhì)，對人體的副作用小，在抗腫瘤方面已展現(xiàn)出獨有特色。沒食子酸（gallic acid, GA）是廣泛存在于綠茶、葡萄等植物中的一種天然植物多酚化合物，在抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等方面具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[3]。近年來，其抗腫瘤活性已在宮頸癌、口腔鱗癌、胰腺癌及膠質(zhì)瘤等多種類型的腫瘤細(xì)胞中得到證實[4]，但其對NSCLC的作用及機制的相關(guān)報道較少。本研究目的在于探究GA對NSCLC A549細(xì)胞凋亡的影響及其可能的分子機制，為沒食子酸應(yīng)用于NSCLC的治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

A549細(xì)胞（上海拜力生物科技有限公司），無血清細(xì)胞冷凍保存培養(yǎng)基（RPMI 1640）及胰蛋白酶（美國Hyclone公司），青霉素鏈霉素溶液及胎牛血清（美國Gibco公司），Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），沒食子酸（純度＞98%）（上海源葉生物科技有限公司），qRT-PCR引物（成都擎科梓熙生物科技有限公司），β-actin及磷酸化酪氨酸激酶1（p-JAK1）抗體（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），酪氨酸激酶1（JAK1）、B淋巴細(xì)胞瘤2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（p-STAT3）抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG（武漢博士德生物科技有限公司），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抗體（美國Omnimabs公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱及酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），流式細(xì)胞儀（德國Tecpar公司），全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，按1︰2傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 MTT法檢測GA對A549細(xì)胞增殖的影響

采用RPM 1640完全培養(yǎng)基調(diào)整A549細(xì)胞密度至1×106個/ml，每孔200 μl接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至70%時去除培養(yǎng)基，隨機分為對照組與不同濃度GA組，GA組每孔分別加入GA終濃度為12、20和28 μg/ml的培養(yǎng)基200 μl；對照組每孔加入200 μl完全培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入90 μl正常培養(yǎng)基及10μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去除培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜110 μl，搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測492 nm各孔吸光度（OD）。細(xì)胞生存率=（藥物組OD值/對照組OD值）×100%，以上實驗重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

調(diào)整A549細(xì)胞密度至2×106個/ml，接種于6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿底部70%時去除培養(yǎng)基，隨機分為對照組與不同濃度GA組，GA組分別加入GA終濃度為12～28 μg/ml的培養(yǎng)基2 ml，對照組加入完全培養(yǎng)基2 ml。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌、離心、收集細(xì)胞，重懸于1×Blinding Buffer液中，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個/ml，取100μl細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min，再加入5 μl PI溶液，室溫避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)

收集正常培養(yǎng)基與不同濃度GA干預(yù)24 h后的A549細(xì)胞，按全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并依據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將上樣緩沖液與蛋白樣品按1︰5比例混合，100℃水煮10 min使蛋白充分變性。根據(jù)蛋白定量檢測結(jié)果，按等量上樣原則，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗稀釋液4℃孵育過夜，復(fù)溫，洗滌，二抗稀釋液室溫孵育1 h，洗滌，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)測定電泳條帶灰度積分。

1.6 qRT-PCR檢測細(xì)胞中JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

給予A549細(xì)胞不同濃度GA干預(yù)24 h后，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用qRT-PCR法測量JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)量。GAPDH引物序列正向 ：5'-ACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，反向 ：5'-GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'。STAT3引物序列正向：5'-ACCAAGCGAGGACTGAGCATC-3'，反向：5'-CAGCCAGACCCAGAAGGAGAA-3'。JAK1引物序列正向：5'-ACCAGGATGCGGATAAATAATG-3'，反 向 ：5'-GTTTCCAAGGTAGCCAAGTATTT-3'。Bax引物序列正向：5'-TTTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3'，反向引物為5'-TGCCACTCGGAAAAAGACCTC-3'。Bcl-2引物序列正向：5'-ATCGCCCTGTGGATGACT GA-3'，反向 ：5'-GAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，用基因相對定量法（2-ΔΔCt）計算目的基因表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，多組間樣本均數(shù)比較前行方差齊性檢驗，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA抑制A549細(xì)胞的增殖

實驗中予以正常培養(yǎng)基、不同濃度GA干預(yù)A549細(xì)胞24 h后，MTT法檢測細(xì)胞生存率，結(jié)果顯示，12～28μg/ml GA作用24 h后，相對于對照組，GA組中A549細(xì)胞生存率分別降低至（80.49±0.17）%、（66.57±0.38）%和（51.81±3.04）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示GA能抑制A549細(xì)胞增殖。進(jìn)一步兩兩比較，12 μg/ml組與20μg/ml組和28μg/ml組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.164和6.910，P=0.014和0.002）；說明GA能抑制A549細(xì)胞增殖，且隨著GA濃度的增加，其對A549細(xì)胞生長抑制作用逐漸增強（見表1）。此外，為進(jìn)一步明確GA干預(yù)時間對A549細(xì)胞生長的影響，給予A549細(xì)胞28μg/ml GA干預(yù)6～48 h，結(jié)果顯示，隨著干預(yù)時間的延長，A549細(xì)胞生存率逐漸降低，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較，0 h組與6 h組比較，6 h組中細(xì)胞生存率降低（t=7.878，P=0.001）；6 h組與24 h組比較，細(xì)胞生存率下降（t=5.329，P=0.006）；6 h組與48 h組比較，48 h組中細(xì)胞生存率進(jìn)一步下降（t=7.630，P=0.002）（見表2）。結(jié)果表明，GA呈濃度、時間依賴性抑制A549細(xì)胞生長。

2.2 GA濃度依賴性誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

給予A549細(xì)胞正常培養(yǎng)基、不同濃度GA干預(yù)24 h，流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞凋亡率（見圖1A），結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為（8.06±0.48）%，12～28 μg/m GA組細(xì)胞凋亡率依次為（9.77±0.11）%、（13.89±0.47）%和（20.56±0.51）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=118.689，P=0.000），進(jìn)一步兩兩比較，12μg/ml GA組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.667，P=0.171）；20μg/ml GA組與對照組比較，細(xì)胞凋亡率增加（5.83±0.45）%（t=-7.867，P=0.001）；28 μg/ml GA組與20 μg/ml GA組比較，細(xì)胞凋亡率增加（6.67±0.49）%（t=-9.150，P=0.001），結(jié)果表明，GA呈濃度依賴性誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，見圖1B。

表1 不同濃度GA干預(yù)A549細(xì)胞24 h后各組細(xì)胞生存率比較 （%，±s）

表1 不同濃度GA干預(yù)A549細(xì)胞24 h后各組細(xì)胞生存率比較 （%，±s）

組別 細(xì)胞生存率對照組100.00±0.00 12 μg/ml GA組80.49±0.17 20 μg/ml GA組66.57±0.38 28 μg/ml GA組51.81±3.04 F值489.203 P值0.000

表2 28μg/ml GA干預(yù)不同時間后各組細(xì)胞生存率比較（%，±s）

表2 28μg/ml GA干預(yù)不同時間后各組細(xì)胞生存率比較（%，±s）

組別 細(xì)胞生存率0 h組100.00±0.00 6 h組64.45±2.56 24 h組51.81±3.04 48 h組48.50±1.85 F值94.809 P值0.000

2.3 GA對各組細(xì)胞中JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響

給予A549細(xì)胞正常培養(yǎng)基、12～28 μg/ml GA干預(yù)24 h后，qRT-PCR檢測細(xì)胞中JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，12 μg/ml GA組與對照組、28μg/ml GA組比較，隨著GA濃度增加，GA組中BaxmRNA表達(dá)逐漸升高（t=-4.721和-7.149，P=0.002和0.000），Bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸降低（t=3.641和7.715，P=0.007和0.000），但各組細(xì)胞中JAK1、STAT3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.012和0.081，P=0.436和0.968）。見圖2。

2.4 GA對A549細(xì)胞中JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot檢測不同濃度GA干預(yù)24 h對A549細(xì)胞中JAK1、STAT3及其磷酸化活性形式和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，探究其凋亡相關(guān)機制。結(jié)果顯示，隨著GA濃度的增加，12μg/ml GA組與對照組、28μg/ml GA組比較，GA濃度依賴性降低細(xì)胞中p-JAK1（t=2.978和8.212，P=0.041和0.001）及Bcl-2蛋白表達(dá)（t=7.520和2.932，P=0.002和0.043），增加Bax蛋白表達(dá)（t=-2.901和-4.647，P=0.044和0.010）；此外，12μg/ml GA組與對照組比較，p-STAT3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.728，P=0.507），但20 μg/ml GA組與對照組、28μg/ml GA組比較，p-STAT3的表達(dá)逐漸降低（t=6.907和4.874，P=0.002和0.008），見圖3、4。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率

圖2 各組細(xì)胞中STAT3、JAK1、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

圖3 不同濃度GA對A549細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖4 不同濃度GA對A549細(xì)胞中JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

細(xì)胞死亡有2種途徑，①病理性死亡，即壞死；②生理性死亡，即凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定條件下遵循自身遺傳基因決定的調(diào)控程序，自動結(jié)束生命周期的過程。但細(xì)胞凋亡并非全都是自發(fā)的程序性死亡，當(dāng)外界環(huán)境影響細(xì)胞后，也會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的增殖和分化異常有關(guān)，也與細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是許多抗腫瘤藥物主要作用機制[5-7]。本研究采用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)觀察不同濃度GA干預(yù)A549細(xì)胞不同時間對A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果顯示，隨著GA濃度的增加，干預(yù)時間的延長，A549細(xì)胞存活率逐漸降低，而凋亡率逐漸增加，且GA與A549細(xì)胞存活率及凋亡率之間存在濃度、時間依賴關(guān)系，與郗艷麗等[8]研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，GA通過抑制A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡實現(xiàn)抗腫瘤作用，但具體機制有待進(jìn)一步研究。

腫瘤的發(fā)生是多因素、多機制參與的結(jié)果，涉及到一系列信號通路的改變，如MAPK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3等信號通路[9-10]。在GA抗腫瘤作用的相關(guān)研究中，LIANG[11]、HE[4]等已證實，GA通過干預(yù)PI3K、MAPK等信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用；但尚未見GA在腫瘤細(xì)胞JAK/STAT3信號通路中作用的相關(guān)性研究報道。

JAK/STAT3信號通路主要由JAK蛋白酪氨酸激酶（JAK）及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）組成，當(dāng)細(xì)胞表面受體與配體如白細(xì)胞介素6（IL-6）或表皮生長因子（EGFR）等結(jié)合時，可使受體酪氨酸激酶JAK磷酸化，進(jìn)而激活胞漿中的STAT3單體，該STAT3單體被p-JAK激活后發(fā)生二聚化，形成p-STAT3，然后穿過核膜進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[12-13]。在正常細(xì)胞中，STAT3蛋白呈短暫性激活，而腫瘤細(xì)胞中的STAT3蛋白則被持續(xù)性激活，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖并抑制細(xì)胞凋亡[14]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞系中普遍存在STAT3的激活，且免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn)55%的NSCLC組織中存在STAT3的激活[15]，表明STAT3的激活與NSCLC的發(fā)生有關(guān)，而抑制STAT3的激活可阻斷腫瘤細(xì)胞中STAT3信號通路，為許多癌癥患者提供一種新的治療方法。

本研究采用qRT-PCR及Western blot檢測細(xì)胞中STAT3信號通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨GA濃度的增加，A549細(xì)胞中JAK1、STAT3基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平無顯著變化，但GA呈劑量依賴性抑制STAT3信號通路中JAK1、STAT3蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制STAT3信號通路的激活，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，最終啟動腫瘤細(xì)胞凋亡程序，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，GA對A549細(xì)胞具有生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，該作用是通過抑制STAT3的磷酸化激活，進(jìn)而抑制STAT3信號通路而實現(xiàn)，這進(jìn)一步完善了GA抗腫瘤作用機制的研究，為GA應(yīng)用于NSCLC的臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)，但應(yīng)用于臨床仍需進(jìn)一步藥物毒性實驗及體內(nèi)實驗研究的支持。