蔡智慧，李鵬，梁義娟，石軍榮，蘇媛媛，謝丹，劉競(jìng)芳

（1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 婦科，河北 保定 071030；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 超聲科，河北 保定 071030；3.河北省保定市第一醫(yī)院 超聲科，河北 保定 071000）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，患者的復(fù)發(fā)率和死亡率均較高。卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力較強(qiáng)，且目前尚缺乏治療卵巢癌的靶向藥物是造成卵巢癌患者預(yù)后較差的重要原因。因此，尋找卵巢癌的治療靶點(diǎn)對(duì)改善卵巢癌患者的預(yù)后具有積極的價(jià)值。微小RNA（MicroRNA, miRNA）是一類在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)作用的非編碼小分子RNA，能夠調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程并影響細(xì)胞的增殖、侵襲及血管新生。miRNA-106a（miR-106a）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有原癌基因特性的miRNA，能夠靶向抑制癌細(xì)胞內(nèi)多種抑癌基因的表達(dá)。在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，miR-106a的高表達(dá)會(huì)抑制抑癌基因的表達(dá)并增強(qiáng)癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[1]。已有研究報(bào)道，miR-106a對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲具有促進(jìn)作用[2]，但關(guān)于miR-106a對(duì)癌細(xì)胞在體條件下增殖、侵襲的影響并未明確。本研究復(fù)制小鼠卵巢癌移植瘤模型并分析瘤內(nèi)注射miR-106a對(duì)卵巢癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SKOV3卵巢癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自上海Hyclone公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自上海Invitrogen公司，miR-106a抑制劑、陰性對(duì)照的抑制劑由上海吉瑪公司合成，SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，RNA抽提試劑盒、互補(bǔ)DNA（complementary DNA, cDNA）第一鏈合成試劑盒實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠卵巢癌移植瘤模型的復(fù)制 培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞，用0.125%的胰蛋白酶消化傳代，取傳代后且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞，離心后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)密度至1×107個(gè)/ml，取0.5 ml細(xì)胞懸液并進(jìn)行皮下注射，注射部位為小鼠右前肢腋窩外側(cè)，注射后7 d測(cè)量腫瘤體積，以腫瘤體積3～4 mm3判斷為模型復(fù)制成功，用于后續(xù)分組和實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 卵巢癌移植瘤小鼠的分組和干預(yù) 取卵巢癌移植瘤小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106a抑制組，每組各8只，干預(yù)方法：①空白對(duì)照組：瘤內(nèi)注射100 μl生理鹽水與3 μl LipofectamineTM2000試劑的混合液；②陰性對(duì)照組：瘤內(nèi)注射95 μl生理鹽水、5 μl陰性對(duì)照抑制劑、3 μl LipofectamineTM2000試劑的混合液；③miR-106a抑制組：瘤內(nèi)注射95μl生理鹽水、5 μl miR-106抑制劑、3 μl LipofectamineTM2000試劑的混合液。每隔4 d注射1次，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大長(zhǎng)徑和最大橫徑，以0.5×最大長(zhǎng)徑×最大橫徑×最大橫徑計(jì)算腫瘤體積。

1.2.3 基因mRNA表達(dá)的檢測(cè) 干預(yù)后第40天，測(cè)量腫瘤體積后處死小鼠，解剖得到移植瘤組織后采用RNA抽提試劑盒分離組織中的總RNA，而后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；取cDNA樣本進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/AKT）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、生存素（Survivin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、MMP-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin），以 βactin為內(nèi)參照計(jì)算PTEN、PI3K、AKT、CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多時(shí)間的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤體體積的變化情況

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106a抑制組干預(yù)前、干預(yù)后10、20、30和40 d時(shí)瘤體體積比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106a抑制組之間的瘤體體積有差異（F=17.685，P=0.000）；②每組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的瘤體體積有差異（F=13.489，P=0.000）；③各組瘤體體積變化趨勢(shì)有差異（F=16.328，P=0.000）。見表1。

2.2 腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT的表達(dá)

干預(yù)后40 d時(shí)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106a抑制組移植瘤小鼠腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT表達(dá)的分析如下：miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中PTEN的mRNA表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），PI3K、AKT的mRNA表達(dá)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

2.3 腫瘤組織中信號(hào)通路下游分子的表達(dá)

干預(yù)后40 d時(shí)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106a抑制組移植瘤小鼠腫瘤組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)的分析如下：miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表達(dá)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表3。

表1 3組移植瘤小鼠瘤體體積的變化情況 （n =8，mm3，±s）

表1 3組移植瘤小鼠瘤體體積的變化情況 （n =8，mm3，±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.05；3）與干預(yù)前比較，P ＜0.05；4）與干預(yù)后10 d比較，P ＜0.05；5）與干預(yù)后20 d比較，P ＜0.05；6）與干預(yù)后30 d比較，P ＜0.05

組別 干預(yù)前 干預(yù)后10 d干預(yù)后20 d干預(yù)后30 d干預(yù)后40 d miR-106a抑制組5.90±0.8246.97±6.941）2）3）92.52±10.251）2）3）4）135.65±17.851）2）3）4）5）188.42±22.461）2）3）4）5）6）陰性對(duì)照組5.98±0.91115.14±18.023）227.14±39.243）4）390.15±45.613）4）629.14±81.253）4）空白對(duì)照組5.92±0.78114.52±16.793）225.96±37.823）4）387.87±42.623）4）624.51±78.783）4）

表2 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT的表達(dá) （n =8，±s）

表2 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT的表達(dá) （n =8，±s）

注：?與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別PTENPI3KAKT miR-106a抑制組2.65±0.39?0.38±0.09?0.41±0.08?陰性對(duì)照組1.05±0.141.06±0.171.02±0.15空白對(duì)照組1.00±0.161.00±0.121.00±0.18 F值23.95120.28512.582 P值0.0000.0000.002

表3 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中信號(hào)通路下游分子的表達(dá) （n =8，±s）

表3 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中信號(hào)通路下游分子的表達(dá) （n =8，±s）

注：?與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別CyclinD1SurvivinMMP-2MMP-9VEGF miR-106a抑制組0.35±0.08?0.32±0.06?0.39±0.06?0.28±0.05?0.23±0.04?陰性對(duì)照組0.98±0.141.03±0.151.05±0.161.07±0.120.97±0.16空白對(duì)照組1.00±0.151.00±0.181.00±0.141.00±0.171.00±0.15 F值18.35221.34816.84328.68222.155 P值0.0000.0000.0000.0000.000

3 討論

卵巢癌的發(fā)病機(jī)制目前仍未明確，臨床上也缺乏治療卵巢癌的靶向藥物。miRNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類具有廣泛生物學(xué)活性的非編碼小分子RNA，能夠與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合并造成mRNA降解或抑制mRNA翻譯。miR-106a是具有原癌基因活性的miRNA，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a在胃癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)趨勢(shì)，且與癌細(xì)胞的增殖活力、侵襲活力密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)李敏等[2]的研究報(bào)道，miR-106a對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲具有促進(jìn)作用，但是關(guān)于miR-106a對(duì)卵巢癌組織生長(zhǎng)的影響未見報(bào)道。本研究以卵巢癌移植瘤小鼠作為研究對(duì)象，通過瘤內(nèi)注射miR-106a的方式來(lái)分析卵巢癌組織中miR-106a的生物學(xué)作用，進(jìn)而對(duì)腫瘤組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：干預(yù)后10、20、30和40 d時(shí)，miR-106a抑制組移植瘤小鼠的瘤體體積均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。這就說(shuō)明miR-106a抑制劑對(duì)卵巢癌移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。

miRNA發(fā)揮生物學(xué)作用主要依賴于對(duì)靶基因表達(dá)的靶向調(diào)控，miR-106a在惡性腫瘤的病情發(fā)展變化過程中起到促進(jìn)作用且對(duì)多種促凋亡基因、抑癌基因的表達(dá)具有靶向抑制作用。PTEN基因是體內(nèi)重要的抑癌基因之一，也是受到miR-106a調(diào)節(jié)的靶基因之一[6-7]。PTEN基因所編碼的蛋白能夠是細(xì)胞內(nèi)的第二信使PIP3脫去3'-磷酸，進(jìn)而影響下游PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，PTEN的表達(dá)減少，低表達(dá)的PTEN會(huì)造成PI3K/AKT激活并促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲及血管新生。通過分析移植瘤組織中PTEN/PI3K/AKT的表達(dá)可知，miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中PTEN的mRNA表達(dá)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，PI3K、AKT的mRNA表達(dá)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。這就說(shuō)明miR-106a能夠靶向調(diào)控卵巢癌組織中PTEN的表達(dá)，抑制miR-106a能夠增加PTEN的表達(dá)并抑制PI3K/AKT的激活。

PTEN所調(diào)控的PI3K/AKT信號(hào)通路具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，細(xì)胞的增殖、侵襲、血管新生等生物學(xué)過程均受到該信號(hào)通路的調(diào)控。PI3K發(fā)生磷酸化后能夠?qū)⒌孜锪字＜〈?，5-二磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻I3P，后者能夠使AKT發(fā)生磷酸化并調(diào)節(jié)多種增殖、侵襲、血管新生相關(guān)靶基因的表達(dá)[8-9]。CyclinD1和Survivin是受到AKT調(diào)控的增殖相關(guān)基因，前者能夠與CDK4、CDK6形成復(fù)合物并加速細(xì)胞周期，后者能夠拮抗多種Caspase分子并抑制細(xì)胞凋亡；MMP-2和MMP-9是MMPs家族中受到AKT調(diào)控的成員，能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)的方式促進(jìn)細(xì)胞侵襲；VEGF是受到AKT調(diào)控的血管新生血管基因，是目前已知促血管新生作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。本研究通過分析移植瘤組織中上述增殖、侵襲、血管新生相關(guān)靶基因的表達(dá)量可知：miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表達(dá)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。說(shuō)明miR-106a對(duì)卵巢癌組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，抑制miR-106a能夠減少增殖、侵襲、血管新生相關(guān)靶基因的表達(dá)。

綜上所述，miR-106a對(duì)卵巢癌組織中PTEN/PI3K/AKT通路具有靶向調(diào)節(jié)作用；瘤內(nèi)注射miR-106a抑制劑能夠通過增強(qiáng)PTEN信號(hào)通路來(lái)抑制卵巢癌移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。