董洪亮，劉乃國，苗雙，鄭靜，倪娜，王楠，成苗青

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2.腫瘤研究中心，山東 濱州 256603）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF），是一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，病因不明，是一種常見的致命性肺部疾病，目前尚無有效的治療方法[1-3]。因而探索其發(fā)病機(jī)制，尋求新的有效的治療措施是非常必要的。

有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT-mTOR通路與心臟纖維化、肝臟纖維化，以及腎臟纖維化等纖維化疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)[4-6]。也有報(bào)道稱該通路可能與肺纖維化發(fā)病有關(guān)[7-8]?；钚跃S生素D3[（1，25-（OH）2D3）]能夠通過影響Wnt通路改善博來霉素所致的小鼠肺纖維化[9]，提示1，25-（OH）2D3可能對(duì)肺纖維化有一定的治療作用。但是1，25-（OH）2D3在大鼠IPF中是否對(duì)PI3KAKT-mTOR通路有影響尚未見報(bào)道。

本研究旨在探討大鼠IPF發(fā)生過程中，肺組織中PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的變化及1，25-（OH）2D3對(duì)此通路的影響，評(píng)價(jià)1，25-（OH）2D3對(duì)大鼠IPF的干預(yù)作用，為揭示肺纖維化的發(fā)生機(jī)制和探討新的治療措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及引物

90只6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠購自魯抗醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心（許可證號(hào)：SCXK魯2013000），博來霉素（日本化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)，15 mg/支，批號(hào)：030201），1，25-（OH）2D3購自德國Sigma公司，HiFi Script Quick gDNA Removal cDNA Kit、Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑（PV-9001/2）、DAB試劑盒（ZLI-9019）購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

應(yīng)用Primer（version 5.0）軟件，根據(jù)大鼠PI3K、AKT、mTOR的基因序列，分析設(shè)計(jì)特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。內(nèi)參基因GAPDH的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，引物序列見表1。

表1 所用引物序列

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

90只200 g左右雄性SD大鼠，隨機(jī)分為模型組、治療組、對(duì)照組，每組各10只。大鼠腹腔注射4%水合氯醛（200～300 μl/只）進(jìn)行麻醉后，模型組和治療組采用單次氣管內(nèi)注射博來霉素（5.0 mg/kg）的方法進(jìn)行肺纖維化模型的復(fù)制[10]，對(duì)照組氣管內(nèi)注射生理鹽水（200 μl/只）。自第2天起，模型組腹腔注射1，25-（OH）2D3的溶劑（200 μl/只，0.1%乙醇和99.9%的丙二醇），1次/2 d；治療組腹腔注射1，25-（OH）2D3[按體重2 μg/kg，1，25-（OH）2D3溶于0.1%乙醇和99.9%的丙二醇][11]，1次/2 d；對(duì)照組腹腔注射生理鹽水（200 μl/只），1次/2 d。各小組于第14、21和28天分別處死10只大鼠，取肺組織進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 肺組織羥脯氨酸含量的檢測(cè)

SD大鼠處死后，取肺組織100 mg，采用堿水解法，根據(jù)羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，取其平均值。

1.4 Real-time PCR法檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)

1.4.1 肺組織總RNA的提取及cDNA的合成

Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度和濃度，以O(shè)D260/280在1.8～2.0為標(biāo)準(zhǔn)。用HiFi Script Quick gDNA Removal cDNA Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA保存于-80℃，備用。

1.4.2 Real-time PCR檢測(cè) 以GADPH作為內(nèi)參基因，用Real-time PCR對(duì)肺組織中PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。反應(yīng)體系：12.5 μl 2×Maxima SYBR Green Mix，1 μl Forward Primer，1 μl Reverse Primer，模板1 μl，RNase-free Water補(bǔ)足至25 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 10 min，變性95℃ 10 s，退火60℃ 10 s，延伸72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平

各組肺組織，4%多聚甲醛固定48 h后，進(jìn)行修塊、脫水、透明、石蠟包埋；組織切片（4μm）經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)（95℃，10 min），去除內(nèi)源性辣根過氧化酶（3% H2O2甲醇溶液，處理20 min）；滴加一抗，4℃過夜，洗滌；滴加相應(yīng)二抗，37℃。孵育1 h，洗滌；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；最后脫水、透明、封片。操作過程中設(shè)陰性對(duì)照，以1%PBS代替一抗。光鏡下進(jìn)行組織觀察、拍照，以胞質(zhì)漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒或斑塊為陽性表達(dá)。Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織羥脯氨酸含量比較

實(shí)驗(yàn)第14、21和28天對(duì)檢測(cè)到的各組羥脯氨酸（HYP）的含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示：第14天HYP含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.536，P=0.003）；第21天HYP含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.964，P=0.000）；第28天HYP含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.524，P=0.000）。兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，模型組和治療組的HYP含量均比相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組的HYP含量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組在各時(shí)間點(diǎn)的HYP含量比相應(yīng)時(shí)間模型組的HYP含量低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量比較（n =10，μg/mg，±s）

表2 各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量比較（n =10，μg/mg，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 第14天 第21天 第28天對(duì)照組481±102452±127475±129模型組832±1371）1 025±741）1 182±751）治療組650±701）2）820±1281）2）858±851）2）F值15.53639.96473.524 P值0.0000.0000.000

2.2 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT及mTOR mRNA表達(dá)比較

實(shí)驗(yàn)第14、21和28天，模型組和治療組中PI3K、AKT及mTOR的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組在各時(shí)間，上述3個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白表達(dá)的比較

蛋白PI3K、AKT及mTOR在各組肺組織中，主要在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中有明顯表達(dá)。

表3 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT及mTOR相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表3 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT及mTOR相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與治療組比較，P ＜0.05

PI3KAKTmTOR第14天 第21天 第28天 第14天 第21天 第28天 第14天 第21天 第28天模型組1.45±0.131）1.72±0.342）2.01±0.272）1.45±0.231）1.72±0.442）2.01±0.312）1.39±0.241）1.92±0.322）2.46±0.532）治療組1.29±0.141.37±0.261） 1.64±0.381.29±0.141.37±0.231）1.64±0.401.24 ±0.311.54±0.391.73±0.33對(duì)照組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 F值41.02317.21411.0769.6368.77617.90135.81023.13115.422 P值0.0280.0000.0000.0330.0000.0010.0100.0030.007組別

實(shí)驗(yàn)第14、21和28天，對(duì)檢測(cè)的3個(gè)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，模型組和治療組在各時(shí)間PI3K、AKT、mTOR 3種蛋白的表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組在各時(shí)間的3種蛋白的表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4和附圖。

表4 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達(dá) （積分吸光度IA，±s）

表4 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達(dá) （積分吸光度IA，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

PI3K（×104）AKT（×104）mTOR（×104）第14天 第21天 第28天 第14天 第21天 第28天 第14天 第21天 第28天模型組5.657±2.531）6.411±1.891）7.133±2.481）5.421±2.431）5.834±1.791）6.605±2.411）4.892±1.211）5.913±2.301）6.861±1.331）組別治療組4.492±2.441）2）5.267±1.221）2）5.841±2.181）2）3.490±1.841）2）4.121±2.091）2）5.042±2.871）2）4.032 ±1.291）2）4.543±1.081）2）5.433±1.431）2）對(duì)照組2.357±1.032.431±0.742.563±1.451.997±0.762.232±1.222.193±1.772.007±0.762.132±1.232.126±1.25 F值13.44210.5447.85221.1328.7687.99124.67419.7099.508 P值0.0040.0120.0000.0090.0000.0310.0270.0060.002

附圖 PI3K、AKT及mTOR在各組大鼠肺組織中的表達(dá)

3 討論

IPF發(fā)病隱匿，至今仍然缺乏有效治療方法，診斷后的平均壽命僅為2～3年[12-13]。HYP含量是評(píng)價(jià)肺纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，模型組肺組織HYP含量在實(shí)驗(yàn)第14、21和28天均高于對(duì)照組；而治療組中肺組織HYP的含量在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于模型組。提示1，25-（OH）2D3對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化有一定的干預(yù)效果。

PI3K是磷脂激酶家族中重要一員，其活化產(chǎn)物PIP3能夠激活A(yù)KT蛋白，進(jìn)一步磷酸化mTOR的Ser2448位點(diǎn)激活mTOR，從而增強(qiáng)細(xì)胞的生長與分化[14]。已有研究報(bào)道PI3K-AKT-mTOR通路參與多種器官的纖維化，本研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)第14、21和28天，模型組肺組織中，PI3K、Akt、mTOR3種基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均高于對(duì)照組；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，各組肺組織中PI3K、AKT、mTOR 3種蛋白在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中有陽性表達(dá)，模型組各類細(xì)胞中陽性信號(hào)強(qiáng)于對(duì)照組。有研究報(bào)道，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[15]，以上定量定位結(jié)果都提示PI3K-AKT-mTOR通路與大鼠肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展有著密切聯(lián)系。

給予1，25-（OH）2D3進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)第14、21和28天，治療組肺組織中PI3K、AKT、mTOR3種基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均低于模型組。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，治療組中3種蛋白在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)信號(hào)也弱于模型組。說明在大鼠肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中，1，25-（OH）2D3對(duì)PI3K-AKT-mTOR通路有一定的抑制作用。

綜上所述，在大鼠IPF的發(fā)生、發(fā)展過程中，PI3K-AKT-mTOR通路起重要作用，1，25-（OH）2D3對(duì)大鼠IPF有一定的治療作用，其作用機(jī)制與抑制PI3K-AKT-mTOR通路有關(guān)。