耿瑞靜,謝明輝,王衛(wèi)民，劉　寒

(華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室，武漢 430070)

團頭魴(Megalobramaamblycephala)俗稱武昌魚，隸屬于硬骨魚綱鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Culterinae)魴屬(Megalobrama)。團頭魴由于其生長速度快、養(yǎng)殖成本低、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，已成為我國主要淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類之一。隨著團頭魴人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖過程中存在近親繁殖、生存環(huán)境遭到破壞等問題，團頭魴資源受到了極大的威脅[1]。

微衛(wèi)星標記(microsatellite)又稱簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)、短串聯(lián)重復(short tandem repeats)或簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism)，目前在水產(chǎn)動物育種研究領域被廣泛應用，主要包括遺傳多樣性研究、品種鑒定和親緣關(guān)系鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和定位等。Neff[2]在藍鰓太陽魚種群研究中成功地應用11個微衛(wèi)星位點鑒定出群體間的親子關(guān)系。Herbinger等[3]采用4個微衛(wèi)星位點在虹鱒魚的繁殖研究中成功鑒定出雙親之間的關(guān)系。另外，在翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)[4，5]、黃河鯉(Cyprinuscarpiohaematoperus)[6]、中華鱘(Acipensersinensis)[7]等研究中，成功驗證了微衛(wèi)星標記在親子鑒定中的應用價值。高澤霞等[8]首次在團頭魴上構(gòu)建親子鑒定平臺，其鑒定準確率達到了98.4%。本研究精選了8對高質(zhì)量多態(tài)性的微衛(wèi)星標記通過計算機模擬分析，探討其在團頭魴親子鑒定中的應用，為保障選育過程中團頭魴譜系清晰，避免近親繁殖，加快團頭魴選育進程奠定良好的基礎。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

本實驗用魚均來自于湖北百容水產(chǎn)良種有限公司，團頭魴親本共有雌魚17尾，雄魚15尾，24尾來自不同選育世代F1、F2、F3、F4親本，8尾來自團頭魴“浦江1號”[9]，其中選育F1、F2、F3、F4分別采用3雄配3雌的方式，“浦江1號”采用3雄配5雌的方式進行自然產(chǎn)卵受精。剪取繁殖親本鰭條并保存于95 %乙醇中。-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ芫逊謩e在孵化缸中單獨孵化，平均水溫約24 ℃，40 h后，魚苗出膜。待魚苗能夠平游后，單獨在水泥池中飼養(yǎng)。魚苗長到約4 cm時，將所有家系魚苗分別混養(yǎng)在1、2和3號池塘中，經(jīng)過一段時間的養(yǎng)殖，分別從1、2、3號塘中隨機采樣66、55、236尾團頭魴子代，并測量其體長和體重，剪取子代鰭條，保存于95 %乙醇中。-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于DNA的提取。

1.2　親本和子代DNA的提取

團頭魴親本和子代DNA的提取采用醋酸銨/異丙醇的方法[10]。

1.3　微衛(wèi)星引物的設計與優(yōu)化

實驗中采用的8對團頭魴微衛(wèi)星引物來自羅偉[11]中的8對微衛(wèi)星，上海生工生物技術(shù)公司合成引物，通過溫度梯度PCR擴增篩選出最佳退火溫度。

1.4　PCR擴增與電泳分析

每對引物分別對親本和子代的DNA進行PCR擴增，PCR擴增反應體系為20 μL，包括：10 μL PCR Mix，微衛(wèi)星正向引物1 μL，微衛(wèi)星反向引物1 μL，模板DNA (100 ng/μL) 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52～59℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖電泳檢測，電壓120 V，電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5　微衛(wèi)星基因型分型

8對微衛(wèi)星引物PCR擴增產(chǎn)物作為上機檢測的樣品，檢測前設置一個空白孔為參照并滴加size marker，其余孔內(nèi)為待檢測的產(chǎn)物樣品。將96孔板放在基因分析儀96孔槽中，然后將marker 1放在對應的槽中，通過基因分析儀(上海凱杰企業(yè)管理有限公司)進行毛細管電泳，為了減少誤差，只統(tǒng)計清晰的條帶。根據(jù)電泳擴增條帶數(shù)目、泳動距離來判斷個體基因型，電泳擴增條帶若為1條帶，則認為該基因座為純合；若表現(xiàn)為2條帶，則認為該基因座為雜合?；蚍治鰞x電泳結(jié)束后，使用ScreenGel軟件進行基因型分析，根據(jù)電泳條帶對應分子大小和濃度，統(tǒng)計微衛(wèi)星引物不同等位基因的分子大小及數(shù)目，數(shù)據(jù)對應整理在Excel中。

1.6　親子鑒定分析

利用Cervus3.0.7軟件的排除法，將數(shù)據(jù)分別整理成父母本和子代編號的文本文件，依次進行等位基因頻率分析、模擬分析和親子分析，最后得到親子鑒定結(jié)果。等位基因頻率分析得到每個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)、無效等位基因頻率和哈迪-溫博格平衡(HW)結(jié)果，用于模擬分析和親子分析。運行模擬10 000次，得到置信水平(95%)的Delta值標準，最后進行親子分析，根據(jù)LOD值(即似然率的自然對數(shù)值)大小最終判定親子關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1　DNA提取

親本和子代的DNA提取后用RNA/DNA紫外分光光度儀檢測質(zhì)量和濃度(圖1)，所有DNA的260 nm/280 nm比值均在1.8～2.1之間，DNA提取質(zhì)量較好。

2.2　微衛(wèi)星引物優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)能夠擴增出清晰條帶的片段范圍得到8對引物對應的最適退火溫度(表1)。圖2為8對引物在最適退火溫度下的優(yōu)化結(jié)果。

圖2　8對微衛(wèi)星引物優(yōu)化結(jié)果Fig.2　The optimization results of 8 microsatellite loci

2.3　微衛(wèi)星基因型分型結(jié)果

經(jīng)過基因分析儀分析的電泳條帶明顯(圖3)，得到對應的峰圖(圖4)。根據(jù)8個微衛(wèi)星位點PCR擴增片段大小，獲得了所有個體的全部微衛(wèi)星位點基因型。通過Cervus 3.0.7軟件模擬分析計算得到每個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、PIC、排除率、無效等位基因頻率(null frequency)及哈迪-溫博格平衡(HW)結(jié)果(表2)，等位基因數(shù)范圍為20～69，平均等位基因數(shù)為35，觀測雜合度范圍為0.623～0.987，期望雜合度范圍為0.908～0.967，平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.867和0.94，PIC值較高，范圍為0.899～0.965，平均值為0.935，大多數(shù)微衛(wèi)星位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。從微衛(wèi)星位點的數(shù)量與排除率之間的關(guān)系(圖5)可以看出：排除率隨著微衛(wèi)星位點數(shù)量的增多也隨之增大；當微衛(wèi)星標記數(shù)量為6時，排除率達到98%以上。

2.4　親子鑒定結(jié)果分析

根據(jù)Cervus 3.0.7軟件分析所有子代都找到了對應的父母本，為了確保結(jié)果的準確性，根據(jù)最終LOD值大小將子代與候選父母匹配，在所有微衛(wèi)星位點出現(xiàn)全部匹配的情況下，并且遵循親本交配原則，最終357尾子代在49個家系中找到了對應的父母本，親子鑒定準確率達到100%(表3)。

圖3　部分團頭魴個體在YP22位點的電泳結(jié)果Fig.3　Electrophoretogram of loci YP22 in partial samples of M.amblycephala

圖4　部分團頭魴個體在YP22位點的峰圖Fig.4　Peaks figures of loci YP22 in partial samples of M.amblycephala

表2 團頭魴各微衛(wèi)星位點的信息Tab.2　Basic information of the SSR loci of M.amblycephala

圖5　微衛(wèi)星位點數(shù)量與排除概率之間的關(guān)系Fig.5　Relationship between the number of microsatellite loci and exclusion probability

表3　團頭魴親子鑒定結(jié)果分布Tab.3　The distribution of paternity of M.amblycephala

家系親本組合母本父本子代個體子代個數(shù)分比例/%3724785 (浦江)25531(浦江)20.563824785 (浦江)25971(浦江)10.283925928 (浦江)24769(浦江)10.284025928 (浦江)25531(浦江)30.8441未標記1 (浦江)24769(浦江)41.1242未標記1 (浦江)25531(浦江)51.443未標記1 (浦江)25971(浦江)30.8444未標記2 (浦江)24769(浦江)10.2845未標記2 (浦江)25531(浦江)30.8446未標記2 (浦江)25971(浦江)51.447未標記3 (浦江)24769(浦江)10.2848未標記3 (浦江)25531(浦江)41.1249未標記3 (浦江)25971(浦江)61.68

3　討論

在親子鑒定技術(shù)引進水產(chǎn)動物育種之前，主要釆用物理標記但有很多不足[12]，比如：標記時需等魚苗長到一定階段時才能注射，注射之前需要對魚苗單獨養(yǎng)殖，消耗大量的養(yǎng)殖設備和人力，而且存在操作繁瑣、易損傷魚體、影響生長、標記保存時間不長等缺陷。隨著分子標記親子鑒定技術(shù)的迅速發(fā)展，微衛(wèi)星分子標記指導親本選配能夠大幅度地避免近交衰退，實現(xiàn)混養(yǎng)，對保護種質(zhì)資源和物種資源進行遺傳改良研究具有非常重要的意義[13]。微衛(wèi)星標記的數(shù)量及多態(tài)性是影響親子鑒定效率的重要因素。相關(guān)研究也證實了微衛(wèi)星在水產(chǎn)動物研究中確認父母本和分析家系關(guān)系的應用價值[14-17]。Vandeputte等[18]用微衛(wèi)星標記在鯉中進行鑒定，有95.3%的子代被分配到父母本，從而準確地進行了遺傳力估計。Norris等[19]采用4 個微衛(wèi)星標記對大西洋鮭(Salmosalar)鑒定親子關(guān)系，有94.3 %的子代找到對應的親本。Sugaya等[20]在日本對蝦親緣關(guān)系研究中利用5個微衛(wèi)星位點鑒定出親子關(guān)系。董世瑞等[21]利用5個微衛(wèi)星位點分別對中國對蝦單獨和混養(yǎng)家系群體進行家系鑒定，其準確率達到92.9%和90.7%。李佳凱等[22]采用3組微衛(wèi)星多重PCR對大黃魚進行親子鑒定，成功率達到了100%。本研究采用的8個多態(tài)微衛(wèi)星標記均屬于高度多態(tài)性的位點(PIC>0.5)，具有條帶清晰、產(chǎn)物穩(wěn)定的優(yōu)點，多個位點均顯著偏離哈溫平衡(P<0.01)，當微衛(wèi)星引物數(shù)量為4以上時排除率均在90%以上，鑒定成功率較高，同樣可以獲得較好的鑒定效果。為了達到更加準確的鑒定結(jié)果，采用8個高質(zhì)量微衛(wèi)星標記在一定程度上保證了親子鑒定的效率。對357個混養(yǎng)子代進行鑒定分析，準確率達到100%，說明團頭魴混養(yǎng)家系的親子鑒定技術(shù)逐漸成熟，為選育工作的順利進行奠定了堅實的基礎。

在實驗中發(fā)現(xiàn)無效等位基因的存在是影響親子鑒定結(jié)果準確性的首要因素。微衛(wèi)星基因分型基于反應，假如產(chǎn)生無效等位基因，使雜合位點的條帶讀取時產(chǎn)生相應的誤差，所以在親子鑒定中不能使用無效等位基因頻率高的微衛(wèi)星位點[23]。通過分析，本研究所選取的8個微衛(wèi)星位點均值低于5%，不存在無效等位基因頻率較高的現(xiàn)象。除了無效等位基因，雜帶非目的片段所在區(qū)域或污染帶非本個體的基因片段也是基因型錯誤判讀的因素之一。在基因型分型過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)條帶不清晰沒有明顯的大小和濃度，雜峰較多，條帶冗雜出現(xiàn)影子帶、帶漂移的現(xiàn)象，基因分析儀在運行時要保持溫度恒定，新卡夾開始使用前需靜置在卡槽中至少20 min，恢復室溫后可放入儀器內(nèi)進行校準，校準好后方可使用。若校準不成功，可以對卡夾進行排膠或長時間排膠。O’Reilly等[24]提出平均每個基因位點有2%～3%的可能存在分型錯誤。本研究選取的微衛(wèi)星位點，擴增后主帶區(qū)(等位基因條帶所在區(qū)域)與雜帶區(qū)(非目的片段所在區(qū)域)區(qū)分明顯，大大降低了誤判概率。尤其是顯示為純合子的個體，采用多個位點判定，所有位點判定結(jié)果一致時才確定為某一家系，有效降低了分型錯誤率。

另外，親子鑒定效率的高低很大程度上取決于微衛(wèi)星位點的多態(tài)性，微衛(wèi)星位點在分析群體時的一些參數(shù)，如等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)性信息含量，它們是評估位點效率的重要依據(jù)?？紤]到微衛(wèi)星位點擴增的質(zhì)量、穩(wěn)定性、是否有雜帶、片段長度等多個因素，最終選擇了優(yōu)化后的8個多態(tài)性微衛(wèi)星位點。與羅偉等[25]利用多重PCR和高澤霞等[8]利用熒光標記引物進行基因型分析方法相比較，本實驗采用簡單PCR擴增進行基因型分型有操作簡便、條帶清晰、準確性高、微衛(wèi)星數(shù)目相對較少、避免了引物間的競爭等優(yōu)點，若微衛(wèi)星標記數(shù)目和群體數(shù)量少，引物間片段大小接近，可采取簡單PCR擴增來提高效率，節(jié)約成本。

本研究8個微衛(wèi)星位點的親子鑒定準確率達到100%，從而實現(xiàn)了團頭魴多個不同家系實施混養(yǎng)，可以節(jié)約成本和減少生存環(huán)境帶來的誤差，有利于新品種的選育，為進行人工養(yǎng)殖、家系選育、品種鑒定和遺傳多樣性等多方面的研究奠定了基礎，加快團頭魴的遺傳選育。