黃宇，黃鳳柳，鄧鑫，郭群，陳綺華，周蒙

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西　南寧　530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西　南寧　530011)

肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cell, HSC)已被證實(shí)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的至要環(huán)節(jié)，在多種慢性肝病(如肝硬化、肝癌等)的病理進(jìn)程中扮演重要作用，以其靶向抗肝纖維化的有關(guān)研究已成為當(dāng)前炙熱的探討領(lǐng)域。天然牛磺酸(Natural Taurine, NTau)是從天然的新鮮海鮮產(chǎn)品中提煉萃取的?；撬?，β-氨基乙磺酸(人體的一種條件必需氨基酸)為其有效的藥理化學(xué)成分，具有多樣生理化學(xué)活性,可抑制大鼠HSC增殖、促進(jìn)其凋亡，具有一定的抑制大鼠肝纖維化作用[1-2]。但其對人HSC是否也有類似作用，目前并未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過將NTau含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的人HSC-LX2細(xì)胞孵育，以期探討不同濃度NTau含藥血清對人HSC-LX2細(xì)胞的作用及其具體作用機(jī)制。

1　材料及方法

1.1　材料

人肝星狀細(xì)胞系HSC-LX2(上海蓋寧生物科技有限公司)；Tunel檢測陽性對照制備試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；四季清胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；DMEM/HIGH高糖培養(yǎng)基(HyClone)等購自南寧市慧研實(shí)驗(yàn)器材經(jīng)營部；天然牛磺酸(NTau，上海國藥控股股份有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，Amresco)；PBS緩沖液(北京索萊寶生物科技有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%，北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

HSC-LX2細(xì)胞在37 ℃、5%CO2外周環(huán)境及飽和濕度等適宜條件下，用含有胎牛血清(10%)、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)、谷氨酰胺(4 mmol/mL)的培養(yǎng)液(RPMI 1640)常規(guī)培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組及給藥

將HSC-LX2細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)至70%融合狀態(tài)，加入胰酶(0.25%)消化，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞以一定密度(5×105/mL)于24孔板中接種。此時細(xì)胞將分為4個實(shí)驗(yàn)組：空白對照組加等量含胎牛血清(10%)的培養(yǎng)液(RPMI 1640)； NTau低、中、高劑量組加等量含胎牛血清(10%)和相應(yīng)NTau(3.0、6.0、9.0 μg/mL)的培養(yǎng)液(RPMI 1640)，共培養(yǎng)1天。

1.2.3MTT法檢測 HSC-LX2細(xì)胞的增殖抑制率

根據(jù)所描繪的生長曲線選取處于對數(shù)生長期的HSC-LX2細(xì)胞，消化、分離，以一定密度(5×105/mL)于24孔板中接種，每孔100 μL。待培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長后再丟棄原培養(yǎng)液，按“1.2.2”項(xiàng)下的方法分組、給藥，繼續(xù)培養(yǎng)1天，每孔加入MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后在酶標(biāo)儀一定波長處(490 nm)測定各孔的光密度值(optical density,OD)，前后共重復(fù)測定3次，然后取各組的平均值，計(jì)算出各組細(xì)胞的增殖抑制率。

抑制率%(IR)=[(1-藥物組OD值)/對照組OD值]×100%

1.2.4TUNEL法檢測 HSC-LX2細(xì)胞凋亡

遵照上述的方法繼續(xù)培養(yǎng)HSC-LX2細(xì)胞2天至細(xì)胞完全貼壁生長后，加入含各劑量NTau的DMEM培養(yǎng)液2 mL(藥物終劑量分別為3.0、6.0、9.0 μg/ml)，同樣的方法加入工作液培養(yǎng)2天后，用多聚甲醛(4%)固定細(xì)胞，嚴(yán)格依照TUNEL凋亡試劑盒的具體要求操作，于熒光顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)算出各組凋亡陽性的細(xì)胞數(shù)及其凋亡細(xì)胞率，紅色為已凋亡細(xì)胞之細(xì)胞核，藍(lán)色則為尚未凋亡細(xì)胞之細(xì)胞核，然后計(jì)算出各組細(xì)胞的凋亡率。

凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)×100%

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測 HSC-LX2細(xì)胞凋亡

遵照上述的方法培養(yǎng)HSC-LX2細(xì)胞2天至細(xì)胞完全貼壁生長后，將上清液丟棄，收集剩下的細(xì)胞；加入事先已預(yù)冷的PBS液(3 mL 4℃)清洗細(xì)胞；加入事先已預(yù)冷的75%乙醇(-20℃)冰浸留夜；用PBS洗2次后加入2 μL RNase A (1 mg/mL)，37 ℃溫水淋浴40 min后再加入100 μL碘化丙啶液(100 μg/mL)暗光染色0.5 h(室溫下，濃度同RNase A液)。用流式細(xì)胞儀分析系統(tǒng)(Epics XL)以104個細(xì)胞的速率檢測每份樣本細(xì)胞(以50～60個細(xì)胞/sec的檢測速率，并以氬離子激光器光所激發(fā)出來的488 nm和633 nm波長的長波通濾片阻斷)。系統(tǒng)自動計(jì)算并分析出各組周期細(xì)胞所占據(jù)的相應(yīng)百分比及其細(xì)胞凋亡情況。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　HSC-LX2細(xì)胞增殖情況比較

結(jié)果表明，NTau可抑制HSC-LX2的細(xì)胞增殖，且其細(xì)胞增殖抑制率隨NTau劑量的增加而相應(yīng)升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1　HSC-LX2細(xì)胞增殖情況比較

注：與空白對照組比較，1)P<0.05；與低劑量NTau組比較，2)P<0.05；與中劑量NTau組比較，3)P<0.05；與高劑量NTau組比較，4)P<0.05

2.2　HSC-LX2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況比較

結(jié)果見表2，NTau可促進(jìn)HSC-LX2的細(xì)胞調(diào)亡，且其細(xì)胞凋亡率隨NTau劑量的增加而相應(yīng)升高(P<0.05)；且處于G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯增高，而處于S期、G2/M期的細(xì)胞百分比則明顯降低。

表2　HSC-LX2細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況比較

注：與空白對照組比較，1)P<0.05；與低劑量NTau組比較，2)P<0.05；與中劑量NTau組比較，3)P<0.05；與高劑量NTau組比較，4)P<0.05

3　討論

肝纖維化系各種慢性肝病的病理性基礎(chǔ)，HSC則是肝臟中主要產(chǎn)生膠原的細(xì)胞，其激活可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展；如果能夠抑制HSC的活化與增殖，在理論上則可減少甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[3]。因此，有關(guān)抑制HSC的增殖或誘導(dǎo)活化后HSC凋亡的研究正日益炙熱起來。?；撬峋哂卸鄻有陨飳W(xué)功能，既是人體內(nèi)的一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是中藥牛黃中的主要有效藥理成分。研究表明，牛磺酸具有減輕肝臟損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能、改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、降低促炎細(xì)胞因子等多種生物學(xué)效應(yīng)[4-5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NTau可通過下調(diào)一些相關(guān)細(xì)胞因子/趨化因子，并減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等來顯著減輕肝纖維化的進(jìn)展程度[6-7]。導(dǎo)師所在課題組亦研究發(fā)現(xiàn)，NTau抑制肝纖維化的作用要勝過人工合成的?；撬?，且谷胱甘肽途徑、神經(jīng)鞘脂途徑和硫胺代謝途徑等在調(diào)節(jié)?；撬岣深A(yù)HSC的過程中起著至關(guān)重要的作用[8-9]。

HSC活化的其中一個顯著特征就是旺盛的細(xì)胞增殖與復(fù)制,是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的最直接原因。無疑就是HSC活化及增殖后自身數(shù)量的增加加上細(xì)胞積聚引起的ECM合成和沉積量的增加。通過采用TUNEL法聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況后發(fā)現(xiàn)，各劑量NTau含藥血清作用HSC-LX2細(xì)胞2天后，處于G0/G1期細(xì)胞的百分比均明顯增高，而處于S期、G2/M期細(xì)胞總數(shù)的百分比則明顯降低，本研究或可表明含NTau藥物血清之所以能抑制HSC的增殖很可能是通過成功阻滯HSC的調(diào)控點(diǎn)從G1期朝S期過渡，進(jìn)而間接抑制DNA的合成及復(fù)制，從而最終干預(yù)HSC細(xì)胞周期，使其不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)。細(xì)胞凋亡系機(jī)體為了維持自身內(nèi)環(huán)境狀態(tài)的穩(wěn)定，由基因整體調(diào)控的細(xì)胞自主、有序而死亡的主動選擇過程，期間涉及許多有關(guān)基因的激活、上調(diào)以及調(diào)控等作用。通過人為誘導(dǎo)活化的HSC凋亡，設(shè)法避免或減少HSC的聚積，阻滯ECM的大量合成、沉積，可有望實(shí)現(xiàn)抗肝纖維化的目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過采用TUNEL法聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，各劑量NTau組HSC-LX2細(xì)胞的晚期凋亡率均明顯高于空白對照組(P<0.05)；而高劑量NTau組HSC-LX2細(xì)胞的晚期凋亡率更是明顯高于低、中劑量NTau組(P<0.05)。綜上結(jié)果表明,不同劑量NTau均可抑制HSC-LX2細(xì)胞的增殖、促進(jìn)HSC-LX2細(xì)胞的凋亡，可整體干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程，并與其劑量成正相關(guān)性。