李書壇 黃純蘭

[摘要] 目的 研究BMP-2聯(lián)合人骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）造血干細胞（HSC）體外增殖的影響。 方法 培養(yǎng)MSC至第三代，磁珠分選儀分選HSC，并用流式細胞術(shù)鑒定MSC與HSC。將獲得的MSC與HSC利用Transwell非接觸共培養(yǎng)，100 ng/mL的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）干預，即實驗分四組：HSC組、HSC+BMP2組、HSC+MSC組、HSC+MSC+BMP2組。培養(yǎng)3 d后比較不同培養(yǎng)條件下HSC計數(shù)、RNA濃度的不同，并通過實時熒光定量PCR法及免疫熒光方法檢測HSC的Ki67的mRNA及蛋白的表達。 結(jié)果 HSC的計數(shù)、總RNA含量、Ki67的表達在HSC+BMP2組高于HSC組、HSC+MSC組高于HSC組、HSC+MSC+BMP2組高于HSC+MSC組（P < 0.05）。 結(jié)論 MSC協(xié)同BMP-2蛋白可促進HSC的增殖。

[關(guān)鍵詞] 造血干細胞；間充質(zhì)干細胞；BMP-2；增殖

[中圖分類號] R331.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（c）-0004-05

The effect of bone marrow mesenchymal stem cell synergistic BMP-2 in the proliferation of hematopoietic stem cell

LI Shutan HUANG Chunlan

Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Southwestern Medical University， Sichuan Province， Luzhou 646000， China

[Abstract] Objective To explore the proliferation effect of bone morphogenetic protein （BMP）-2 on hematopoietic stem cell （HSC） cocultured with mesenchymal stem cell （MSC）. Methods MSCs were expanded to the third passage （P3） in the plastic dish； CD34+ cells were sorted by MACS Miltenyi Biotec. MSCs（P3） and HSCs were identified by FCM separately， and then MSC （P3） and HSC were co-cultured in the Transwell interfered with BMP-2 protein， four groups in the study： HSC group， HSC+BMP2 group， HSC+MSC group， HSC+MSC+BMP2 group. Cells were collected after 3 d to test HSC proliferation using the following methods：counting of the number， detecting of the total RNA， the mRNA and protein expression of Ki67 were detected by fluorescence qRT-PCR and immunofluorescence methods. Results The number of HSC， totel RNA， Ki67 expression of the HSC+BMP2 group was higher than HSC group， HSC+MSC group was higher than HSC group， HSC+MSC+BMP2 group was higher than HSC+MSC group （P < 0.05）. Conclusion MSCs synergistic with BMP-2 can enhance MSC proliferation effect on HSC.

[Key words] Hematopoietic stem cell； Mesenchymal stem cell； BMP-2； Proliferation

造血干細胞（hematopoietie stem cells，HSC）自我更新及多向分化等生理過程都離不開其生存的微環(huán)境增殖。骨髓基質(zhì)細胞及其前體間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）以及它分泌的黏附分子、細胞因子和細胞外基質(zhì)形成復雜的信號網(wǎng)絡，它們共同構(gòu)成的微環(huán)境即微龕“niche”調(diào)控著HSC的增殖等。從微環(huán)境的角度研究MSC對HSC的增殖作用及其機制是當前的研究熱點[1-3]。BMP-2蛋白是多功能蛋白，可直接參與造血的調(diào)控，對造血表現(xiàn)出抑制、促進[4-5]等作用，此外BMP-2能促進新骨的形成，同時新生出血管。已有大量研究證實MSC對HSC具有增殖作用[6]，其依賴于細胞直接接觸間的相互作用、分泌的細胞外基質(zhì)和細胞因子[7-8]，且接觸比非接觸共培養(yǎng)具有更強的擴增作用[9]。本研究利用Transwel的上室底部網(wǎng)板微孔直徑僅0.4 μm，使得上室的HSC不能進入下室，排除了細胞間直接接觸對HSC增殖的影響，但細胞分泌的細胞因子可以通過該微孔，利于探討這種作用可能是通過MSC分泌的細胞因子促進了HSC的增殖。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；鼠抗人ECD-CD34、PEcy7-CD45、FITC-CD105、IgG抗體（美國Pharminge公司）；鼠抗人FITC-Ki67抗體（上海雷浩信息科技有限公司）；干細胞因子（stem cell factor，SCF）、白介素-3（interleukin-3，IL-3）（美國Peprotech公司）；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）（RD公司）；流式細胞儀（美國BECKMAN公司），Mini MACS免疫磁性吸附柱分離裝置和CD34+細胞選擇試劑盒（德國Mitenyi Biotec公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司），PCR試劑盒（德國QIAGEN公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；引物：β-actin上游AGAGATGGCCACGGCTGCTT，下游ATTTGCGGTGGACGTGGAG，Ki67上游CAAGCCACA？鄄GTCCAAGAGAA，下游GTGTCCATAGCTTTCCCTAC？鄄TG（上海生工生物工程股份有限公司）；Transwell小室（美國Costar公司）；PCR儀（羅氏公司）；熒光顯微鏡（羅氏公司）等。

1.2 方法

1.2.1 間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和鑒定

取年齡20～45歲健康正常人髂骨骨髓液（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準及取得供者知情同意），與完全培養(yǎng)基按體積比為1∶4混合后于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)（完全培養(yǎng)基成分為89%LD-DMEM+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素）。3 d換液1次，細胞融合達80%用0.25%胰蛋白酶消化1∶2傳代，傳至第三代（P3）備用，流式檢測MSC表面抗原CD105、CD34-ECD及CD45。

1.2.2 CD34+細胞的分選及純度鑒定

用Ficoll分選骨髓液中單個核細胞，根據(jù)miniMACS免疫磁性吸附柱分離裝置，用CD34+細胞選擇試劑盒按照其說明進行CD34+細胞的分離。流式檢測所分選細胞的純度。

1.2.3 共培養(yǎng)

實驗分四組，HSC組：HSC單獨培養(yǎng)，HSC+BMP2組：HSC添加BMP-2蛋白，HSC+MSC組：HSC種于Transwell上室、MSC種于下室，HSC+MSC+BMP2組：共培養(yǎng)并添加BMP-2，每組4復孔。CD34+細胞1.0×105個/孔，MSC 3.0×106個/孔，rhBMP-2濃度為100 ng/mL，每孔總體積700 μL（89%IMDM+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素，IL-3濃度10 ng/mL、SCF50 ng/mL）。重復3次。

1.2.4 檢測HSC的增殖情況

培養(yǎng)72 h后收集HSC，流式細胞儀檢測HSC的表面抗原CD34的表達情況；計數(shù)板計數(shù)造血干細胞的數(shù)目，Trizol法提取HSC的RNA并用紫外線分光光度儀測其濃度，實時熒光定量PCR法檢測其Ki67 mRNA的表達；細胞經(jīng)多聚甲醛固定，破膜，封閉，F(xiàn)ITC標記的Ki67抗體孵育，洗滌等處理后，熒光顯微鏡觀察Ki67在細胞核內(nèi)的表達。重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分選出的細胞的生物學鑒定

2.1.1 間充質(zhì)干細胞

2.1.1.1 原代培養(yǎng)72 h可見散在的梭形貼壁細胞，第14天細胞融合度可達80%～90%，排列成放射狀、漩渦轉(zhuǎn)。P3代細胞在24 h內(nèi)大多能貼壁。見圖1。

2.1.1.2 流式鑒定第三代MSC的CDl05、CD34、CD45表達，MSC表達非造血相關(guān)免疫標記CDl05，不表達造血相關(guān)免疫標記CD34、CD45。見圖2。

2.1.2 造血干細胞

經(jīng)磁珠分選后的CD34+細胞呈大小均一的小圓形，經(jīng)胎盤蘭染色后98%細胞拒染。流式細胞儀檢測經(jīng)磁珠分選后的CD34+細胞的純度為86.3%。

2.2 共培養(yǎng)第3天各組HSC的免疫表型

共培養(yǎng)3 d收集各組HSC，流式檢測其表面抗原CD34的表達，各組HSC仍高表達CD34，均高于80%。見圖3。

2.3 共培養(yǎng)第3天各組HSC的增殖比較

2.3.1 細胞計數(shù)及熒光定量PCR

HSC的細胞計數(shù)、總RNA及增殖活性基因Ki67的表達在HSC+MSC+BMP2組高于HSC+MSC組，HSC+MSC組高于HSC組，HSC+BMP2組高于HSC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3.2 Ki67免疫熒光

FITC標記的Ki-67在各組HSC上表現(xiàn)為片狀翠綠色熒光，顯示Ki-67蛋白的分布基本覆蓋整個細胞核。且可以看出Ki67熒光強度在HSC+MSC+BMP2組高于HSC+MSC組，HSC+MSC組及HSC+BMP2組高于HSC組。見圖4（封三）。

3 討論

全骨髓貼壁法是目前培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的重要方法之一，有操作簡便、所培養(yǎng)出的細胞活性高等優(yōu)點。我們采用該方法培養(yǎng)出的MSC具有貼壁生長的特性，其生長特點與文獻報道的相符合[10-11]，表達非造血相關(guān)免疫標記CD105，而不表達造血相關(guān)免疫標記CD34和CD45，且在前期的實驗中本課題組已對其成骨、成脂能力進行鑒定[12]。CD34仍然是目前公認的分選造血干細胞的主要免疫標記，本研究應用免疫磁珠法分選出的CD34+造血干細胞的純度及活性高。

Ki67基因與細胞增殖相關(guān)，其表達的核蛋白，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，在增殖期細胞表達，靜止期細胞不表達。Ki67的陽性率越高，細胞增殖越活躍。本研究應用PCR法及免疫熒光兩種方法檢測Ki67在不同組中的表達，以比較HSC的增殖能力。此外，細胞數(shù)目的增加及增殖能力的增強可伴有總RNA增加。故本研究選用細胞計數(shù)、總RNA、Ki67來評估不同干預條件下HSC的增殖能力，并且發(fā)現(xiàn)BMP-2和/或MSC可以促進HSC增殖，且增殖后的HSC經(jīng)流式細胞學鑒定仍高表達CD34。

本實驗應用Transwell將MSC與HSC進行非接觸共培養(yǎng)，根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC可以促進HSC增殖，這可能是MSC分泌了相關(guān)的活性物質(zhì)經(jīng)Transwell的下室穿過Transwell的網(wǎng)膜進入上室，促進HSC增殖。BMP/TGF-β家族對HSC的調(diào)控作用很復雜，且與特定環(huán)境的精細調(diào)控相關(guān)[13-15]。BMP-2對HSC增殖的影響與HSC培養(yǎng)的時間及模式、BMP-2的濃度以及所聯(lián)合的細胞因子種類等具體的環(huán)境相關(guān)[13-16]。本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3 d濃度為100 ng/mL的BMP-2有促進HSC增殖的作用。rhBMP-2在體外和體內(nèi)均能促進MSC的增殖[17]，并能促進MSC分泌造血生長因子，如IL-6、IL-11、G-CSF和SCF等。根據(jù)本研究，BMP-2協(xié)同MSC較MSC單獨對HSC的增殖作用更強，說明BMP-2協(xié)同MSC對HSC有增殖作用，由此推測這種增殖作用可能是BMP-2促進MSC分泌了促HSC增殖的相關(guān)因子。

研究表明[18]BMP信號通路可通過成骨niche，也可能通過血管niche調(diào)控造血[19]。與前者相比，血管niche能促進HSC增殖、分化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)的BMP-2協(xié)同MSC對HSC的增殖作用是否是通過促進血管形成相關(guān)物質(zhì)的表達相關(guān)，在下一步實驗中我們將繼續(xù)探討。

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（收稿日期：2018-00-00 本文編輯：任 念）