楊永梅 嵇眀翔 楊 穎 謝安建 沈玉華＊,

(1安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，現(xiàn)代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230601)(2黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黃山 245041)

癌癥已成為危害公眾健康的重大疾病之一。多年來國內(nèi)外研究者一直致力于行之有效的癌癥治療方法的探尋,使得診治該疾病的方法得到了快速發(fā)展?，F(xiàn)在化療和放療是臨床上應(yīng)用最廣泛的方法，但其所用藥物副作用大，讓病人產(chǎn)生巨大的痛苦[1-2]。因此，近年來毒副作用有所降低的光熱療法[3]、磁熱療法[4]、免疫療法[5]和微波療法[6]等不斷被開發(fā)出來，為癌癥治療提供了新的選擇，但單一療法仍無法得到令人滿意的效果，探索多模式協(xié)同抗癌的治療方法成了新的研究方向。另一方面，眾多優(yōu)異的藥物載體如介孔硅[7]，介孔碳[8]和金屬有機(jī)框架化合物[9]等被合成出來。其中，介孔二氧化硅(mSiO2)是近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用的藥物載體。它具有較大的比表面積、高孔容、可調(diào)孔徑以及優(yōu)良生物相容性等特點(diǎn)[10]。但是，單一的化療效果不理想，且單純的mSiO2無法將藥物精準(zhǔn)地運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位。

氧化石墨烯(GO)是一種擁有單原子厚度的二維碳材料，不僅擁有較高的比表面積，為負(fù)載藥物分子提供平臺(tái)，而且具有優(yōu)異的光熱性能，因而可作為光熱效果治療腫瘤組織方法[11-12]中的理想材料。 但由于石墨烯片層之間有較強(qiáng)的范德華力作用[13]，使其容易發(fā)生團(tuán)聚。因此，對(duì)其表面進(jìn)行修飾并與其他材料復(fù)合是防止其團(tuán)聚的有效措施。另外，F(xiàn)e3O4是一種典型的磁性材料，將一些藥物載體材料與之復(fù)合，借用外磁場可以實(shí)現(xiàn)藥物的靶向傳輸。例如Fe3O4/MoS2[14]，F(xiàn)e3O4@zirconium[15]以 及 Fe3O4@NH2@MOF-5[16]等復(fù)合物均利用Fe3O4的優(yōu)異磁性實(shí)現(xiàn)了藥物的靶向傳輸，提高了治療效果。

鑒于此，本論文提出一種新的具有協(xié)同作用的靶向藥物傳輸方法。如Scheme 1所示，首先對(duì)制備的Fe3O4納米粒子進(jìn)行氨基化修飾，再與GO復(fù)合，形成GO/Fe3O4復(fù)合物。然后，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為一種致孔劑，使SiO2沿著石墨烯兩側(cè)生長，構(gòu)建一種類似“三明治”結(jié)構(gòu)的GO/Fe3O4@mSiO2，再將GO還原得到rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合載體材料。SiO2具有大量的介孔結(jié)構(gòu)，使復(fù)合材料具有較大的比表面積和孔容，利于載藥。同時(shí)，復(fù)合材料中的Fe3O4作為磁靶向物質(zhì)，可將藥物有效運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位。GO具有優(yōu)異的光熱性能，可在靶向定位后對(duì)腫瘤區(qū)域進(jìn)行光熱治療有望實(shí)現(xiàn)協(xié)同抗癌治療效果。

Scheme 1 Preparation,drug loading and controlled release of rGO/Fe3O4@mSiO2nanocomposites

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和材料

石墨片，高錳酸鉀(KMnO4)，硝酸鈉(NaNO3)，六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，乙二醇(C2H6O2)，乙酸鈉(CH3COONa)，聚乙二醇(Mr=1 500)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和二甲亞砜(DMSO)購于國藥試劑有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，正硅酸乙酯(TEOS)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；五氟尿嘧啶(5-FU)，Hoechst 33342，碘化吡啶(PI)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT)，胰酶(0.25% 含 EDTA，GIBCO)，DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(GIBCO)購自上海生工生物工程有限公司。以上試劑均為分析純，未經(jīng)進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.0 MΩcm)。

1.2 儀器和設(shè)備

所用儀器包括紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800，日本島津)、熒光顯微鏡(DMI3000B，德國徠卡)、酶聯(lián)免疫檢測儀 (RT-2100C，深圳鐳拓)。采用NEXUS-870 FTIR型傅里葉變換紅外光譜儀，利用溴化鉀壓片法來檢測樣品結(jié)構(gòu)；采用DX-2700型X射線衍射儀(Cu Kα射線作為發(fā)射源，波長為0.154 056 nm，衍射角 2θ為 5°～90°)對(duì)樣品的物相進(jìn)行分析，測試電壓為40 kV，電流為100 mA；采用SU 1510型掃描電子顯微鏡(加速電壓10 kV)和JEM 100SX型透射電子顯微鏡(加速電壓200 kV)，觀察產(chǎn)物形貌與結(jié)構(gòu)；采用ELSZ-2型ζ電位分析儀(日本大塚電子株式會(huì)社)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行ζ電位測量；采用3H-2000BET-A型比表面測試儀器對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行N2吸附-脫附和孔徑測定。產(chǎn)物的磁學(xué)性質(zhì)測試在MPMS XL-7型精密SQUID磁學(xué)測量系統(tǒng)(美國量子設(shè)計(jì)公司)上進(jìn)行。采用Fluke Ti32熱紅外攝像機(jī)對(duì)樣品光照前后進(jìn)行熱紅外圖像采集。

1.3 rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合載體的制備

參照文獻(xiàn)報(bào)道的Hummers法和溶劑熱法分別制備GO納米片[17-19]和Fe3O4納米粒子[20]，備用。將150 mg Fe3O4納米粒子分散于100 mL無水乙醇中，緩慢滴加5 mL的APTES，超聲5 min后，再磁力攪拌6 h，對(duì)其表面進(jìn)行氨基化修飾，再磁鐵分離。然后將修飾后的Fe3O4納米粒子分散于75 mL去離子水中，制備濃度為2 mg·mL-1的氨基化Fe3O4納米粒子懸浮液。配制0.25 mg·mL-1的GO溶液150 mL，加入20 mL 2 mg·mL-1氨基化的Fe3O4納米粒子溶液，加熱至40℃并攪拌2 h。然后加入1.5 g CTAB，待完全溶解后，緩慢滴加1.5 mL TEOS，40℃條件下持續(xù)攪拌24 h。然后在6 000 r·min-1下離心分離并用熱乙醇(40℃)清洗2次，再用0.45 μm的水系微孔濾膜抽濾，取濾膜上的固體，純水和乙醇清洗多次，真空干燥，得到GO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合材料。最后在氬 (Ar)氣氛下550℃煅燒3 h,得到rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合載體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥物負(fù)載及釋放

抗癌藥物5-FU的負(fù)載：稱取5 mg制備的rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合載體加入到5 mL的1 mg·mL-15-FU溶液中，超聲分散后，在搖床上振蕩24 h，得到rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU懸浮液。離心分離，取上層清液稀釋30倍測定吸光度。根據(jù)5-FU標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用公式(1)計(jì)算載藥率(DLR)。

藥物釋放：取10 mg的rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU加入到50 mL pH值分別為7.4和5.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，振蕩并在0～48 h內(nèi)多次取溶液離心，取上層清液0.1 mL稀釋至3 mL，測定吸光度并計(jì)算藥物釋放率。原溶液中每次取出溶液后均補(bǔ)加0.1 mL PBS，保持總體積不變，并且后面所取樣品的吸光度均為其前所有吸光度數(shù)值的總和。其中光照組在藥物釋放8 h時(shí)光照10 min再繼續(xù)相同的操作，計(jì)算并繪制出藥物釋放行為曲線。

1.5 細(xì)胞毒性測試

選用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測rGO/Fe3O4@mSiO2的生物相容性以及對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷能力。首先將所制備的rGO/Fe3O4@mSiO2與rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU復(fù)合物配制為濃度為1 mg·mL-1的懸浮液，用紫外光照10 min進(jìn)行滅菌處理，然后用DMEM培養(yǎng)基稀釋至0.1、0.01和 0.001 mg·mL-1，保存?zhèn)溆谩?將HeLa細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種到96孔板，并置于含有5%(V/V)CO2的培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)24 h。然后移去培養(yǎng)基，加入100 μL稀釋后的復(fù)合物-培養(yǎng)基溶液(包括對(duì)照組)，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別設(shè)置避光與光照條件，其中光照組在4 h后取出，并利用808 nm近紅外光照10 min再放回。置于CO2培養(yǎng)箱中孵化24 h后，移去培養(yǎng)基，加入20 μL MTT檢測液，繼續(xù)孵化4 h后，去除上層液，加入100 μL DMSO溶液，持續(xù)振蕩，完全溶解后使用酶聯(lián)免疫檢測儀進(jìn)行檢測490 nm處的吸光值(OD值)，并用公式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率(RCV),其中ODexp、ODbla和ODcon分別為實(shí)驗(yàn)組、空白組和對(duì)照組的OD值。

1.6 細(xì)胞熒光顯微鏡圖像分析

為了進(jìn)一步研究復(fù)合材料對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷效果，利用Hoechst 33342和PI雙染色的方法觀察細(xì)胞凋亡情況[21-22]。HeLa細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)接種在6孔板上，在含5%(V/V)CO2，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后分別將3 mL內(nèi)含1 mL rGO/Fe3O4@mSiO2與rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU溶液的培養(yǎng)基加入到6孔板中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設(shè)置避光與光照條件進(jìn)行對(duì)照，其中光照組在4～6 h后取出并利用808 nm近紅外激光照射10 min后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h。最后取出6孔板，棄去培養(yǎng)基，用pH=7.4的PBS沖洗，再使用0.5 mL的Hoechst 33342(10 μg·mL-1)和 0.5 mL 的 PI(10μg·mL-1)溶液分別對(duì)其進(jìn)行染色10 min，然后用PBS清洗干凈，固定后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的形貌表征

為了解產(chǎn)物的形貌及尺寸，對(duì)其進(jìn)行了SEM測試。圖1A和B分別為GO與Fe3O4的SEM圖，可以看出GO為薄片層狀結(jié)構(gòu)并伴有明顯的褶皺，而Fe3O4為尺寸均勻的納米微球，粒徑約為200 nm。圖1C顯示Fe3O4納米球均勻地分布在GO表面，表明氨基化的Fe3O4與GO成功地復(fù)合。而在圖1D中可以看出，rGO/Fe3O4@mSiO2具有明顯的二維平面結(jié)構(gòu)，尺寸約為4 μm的片層相互堆疊，其表面已看不到Fe3O4納米球。這可能是由于介孔SiO2覆蓋于GO/Fe3O4表面上下兩層，將其包裹起來形成類似“三明治”結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料。

圖 1 GO(A)、Fe3O4(B)、GO/Fe3O4(C)和 rGO/Fe3O4@mSiO2(D)的掃描電子顯微鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of GO(A),Fe3O4(B),GO/Fe3O4(C)and rGO/Fe3O4@mSiO2(D)

2.2 產(chǎn)物的X射線衍射（XRD）和紅外光譜（FTIR）圖分析

圖2A為不同樣品的XRD圖，從圖2A-a可以看出， 物質(zhì)的主要峰位在 2θ 為 30.1°、35.4°、43.1°、56.9°和 62.5°處(以△表示)，分別對(duì)應(yīng) Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(511)，(440)晶 面(PDF No.65-3107)。圖2A-b在10.2°出現(xiàn)一個(gè)GO的特征峰(以■表示)。從圖2A-c可以同時(shí)看到Fe3O4和GO的特征峰，GO的特征峰偏移至11°左右，可能是由于氨基化的Fe3O4與GO復(fù)合對(duì)其的影響。如圖2A-d所示：除Fe3O4的特征峰外，在23°～26°處出現(xiàn)一個(gè)寬峰可能是因?yàn)閞GO與SiO2的特征吸收峰在此處相互重疊而形成的，表明rGO/Fe3O4@mSiO2成功合成。為進(jìn)一步證明這一結(jié)論，又對(duì)制備過程各階段產(chǎn)物進(jìn)行了紅外光譜測試 (圖2B)。從Fe3O4紅外光譜圖可以看出在570 cm-1處有歸屬于Fe3O4的Fe-O鍵的特征伸縮振動(dòng)峰[23]。GO/Fe3O4復(fù)合物的FTIR光譜圖中，在1 655 cm-1位置出現(xiàn)C=O振動(dòng)吸收峰，這是因?yàn)镚O中含有大量的羧基。而加入了表面活性劑CTAB修飾后的 GO/Fe3O4， 在 2 917、2 849 和 1 486 cm-1位置均有出峰，分別歸屬于CTAB分子中的-CH3和-CH2-基團(tuán)的C-H伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰。在GO/Fe3O4@mSiO2的FTIR圖中， 約 810、965 cm-1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于Si-O-Si的伸縮振動(dòng)吸收峰和Si-OH的振動(dòng) 峰[24]， 說明成功合成了GO/Fe3O4@mSiO2。同時(shí)，可以看出CTAB峰明顯減弱，可能是由于其在清洗過程中被大量除去。通過Ar氣氛中高溫煅燒，CTAB的振動(dòng)吸收峰基本消失，表明CTAB發(fā)生改變，而GO的C=O振動(dòng)特征峰也隨之減弱，這可能是由于在高溫煅燒過程中CTAB分解產(chǎn)生的碳及氨作為還原劑將GO轉(zhuǎn)化為rGO,生成了最終產(chǎn)物rGO/Fe3O4@mSiO2。

圖 2 (A)Fe3O4(a)、GO(b)、GO/Fe3O4(c)和 rGO/Fe3O4@mSiO2(d)的 XRD 圖;(B)樣品的 FTIR 譜圖Fig.2 (A)XRD patterns of Fe3O4(a),GO(b),GO/Fe3O4(c)and rGO/Fe3O4@mSiO2(d);(B)FTIR spectra of different samples

2.3 rGO/Fe3O4@mSiO2的形成機(jī)理探討

為了探討復(fù)合載體的形成機(jī)理，我們分別測定了各中間產(chǎn)物的ζ電位(圖3)。Fe3O4納米粒子ζ電位為-11.8 mV，是由于在水分散液中其表面富含羥基。利用APTES修飾后ζ電位為38.9 mV，表明Fe3O4納米粒子表面被修飾了氨基，顯正電荷，并可以較穩(wěn)定地在溶液中分散。因此，經(jīng)APTES修飾Fe3O4納米粒子可通過靜電引力與帶負(fù)電荷(-52 mV)的GO復(fù)合，形成GO/Fe3O4復(fù)合物。由于GO負(fù)電荷較多，復(fù)合后總體顯負(fù)電，電位為-13.1 mV。加入帶正電荷的CTAB后，可以利用靜電引力吸附在GO表面上下兩層[25-27]，使得GO/Fe3O4-CTAB復(fù)合物顯正電(18.1 mV)。之后引入 TEOS，TEOS聚集在CTAB周圍發(fā)生水解和縮聚生成SiO2，而且其異質(zhì)成核過程主要發(fā)生在GO/Fe3O4表面，形成了類似“三明治”結(jié)構(gòu)的GO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合材料。再經(jīng)Ar氣氛的煅燒后，CTAB分子碳化分解，同時(shí)GO被還原。生成的rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合載體經(jīng)測定呈負(fù)電性(-25.7 mV)。ζ電位分析表明：產(chǎn)物形成的機(jī)理主要是各反應(yīng)物層與層之間的靜電吸附作用。

圖3 不同樣品的ζ電位分布圖(25℃)Fig.3 ζ potential distribution of different samples(25℃)

2.4 產(chǎn)物的磁性和光熱性能分析

為了研究所制備產(chǎn)物的磁學(xué)性質(zhì)，測試了Fe3O4和rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合物在室溫下(300 K)的磁化強(qiáng)度隨磁場變化的情況，并繪制曲線如圖4A所示。Fe3O4納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為65 emu·g-1，而rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合物的飽和磁化強(qiáng)度則降低至32 emu·g-1。導(dǎo)致磁化強(qiáng)度降低的原因可能是由于SiO2與rGO的介入導(dǎo)致相同質(zhì)量復(fù)合物中Fe3O4所占比重降低。低磁場放大圖表明其呈現(xiàn)順磁性，矯頑力約40 Oe。rGO/Fe3O4@mSiO2的磁性使其在作為藥物載體時(shí)具有磁靶向特性。另外，為檢測復(fù)合物光致生熱性能，采用Fluke Ti32熱紅外攝像儀對(duì)808 nm光 照 前 后 的 去 離 子 水 、Fe3O4、GO、GO/Fe3O4、GO/Fe3O4@mSiO2以及rGO/Fe3O4@mSiO2水分散液進(jìn)行熱紅外圖像采集，光照時(shí)間為10 min。從圖4B中發(fā)現(xiàn)相較于去離子水，F(xiàn)e3O4、GO以及納米復(fù)合物GO/Fe3O4、GO/Fe3O4@mSiO2和 rGO/Fe3O4@mSiO2水分散液溫度均有升高，其中GO/Fe3O4比Fe3O4和GO都高，表明Fe3O4對(duì)GO有一定的協(xié)同光熱效果[28]；同時(shí)，rGO/Fe3O4@mSiO2也比 GO/Fe3O4@mSiO2水分散液升溫更多，說明GO被還原后光熱效果更好；因此，濃度相同的rGO/Fe3O4@mSiO2升溫最高，達(dá)到18℃，可能是由于rGO更好地光熱性能以及GO與Fe3O4復(fù)合的協(xié)同影響作用。同時(shí)，為考察納米復(fù)合物循環(huán)使用情況，激光循環(huán)照射和冷卻4次并分別測量其水分散液的溫度，從圖4B溫度變化曲線可以看出4次循環(huán)后GO水分散液溫度波動(dòng)范圍在27.5～28.9℃之間，而rGO/Fe3O4@mSiO2幾乎未見溫度波動(dòng)，表明rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合物具備良好的光熱穩(wěn)定性。

圖4 (A)Fe3O4(a)、rGO/Fe3O4@mSiO2(b)的磁滯回線;(B)樣品水分散液在808 nm激光循環(huán)照射和冷卻4次的溫度變化曲線Fig.4 (A)Magnetization curves of Fe3O4(a)and rGO/Fe3O4@mSiO2(b);(B)Photothermal curves of aqueous dispersion of different samples under 808 nm irradiation/cooling four cycles

2.5 N2吸附等溫線、孔徑分布和藥物的負(fù)載與釋放

從rGO/Fe3O4@mSiO2的N2吸附等溫線與孔徑分布圖(圖5A)可知，該等溫線為Ⅳ型吸附平衡等溫線，而遲滯環(huán)屬于H3型，主要對(duì)應(yīng)于材料的狹縫型孔，在較高相對(duì)壓力區(qū)域沒有表現(xiàn)出吸附限制，這說明了材料以介孔為主。吸附量隨著相對(duì)壓力P/P0增大而緩慢增加，在相對(duì)壓力P/P0達(dá)到0.4～0.5時(shí)，吸附量出現(xiàn)激增現(xiàn)象，表明從該相對(duì)壓力開始，材料中的介孔孔道內(nèi)發(fā)生毛細(xì)管凝聚現(xiàn)象，進(jìn)一步證明介孔結(jié)構(gòu)的存在且孔徑較均勻；在相對(duì)壓力達(dá)到1.0左右，吸附量達(dá)到最大。rGO/Fe3O4@mSiO2的BET比表面積和孔容分別為 217 m2·g-1和 0.047 8 cm3·g-1，孔徑為3.92 nm左右。說明這種方法制備的rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合材料擁有較大的比表面積與孔容，有利于藥物分子的負(fù)載。

為驗(yàn)證rGO/Fe3O4@mSiO2藥物負(fù)載能力，我們測定了負(fù)載前后5-FU溶液在266 nm處的吸光度(圖5B)，利用其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合物對(duì)5-FU的裝載量。根據(jù)計(jì)算可知，負(fù)載率為57.34%。rGO/Fe3O4@mSiO2具有如此優(yōu)異的載藥性能主要是由于其mSiO2和rGO均具有豐富的介孔結(jié)構(gòu)以及較大的比表面積，兩者復(fù)合更加增強(qiáng)了對(duì)藥物的負(fù)載能力。為證明rGO/Fe3O4@mSiO2作為藥物載體的優(yōu)勢，我們進(jìn)一步做了藥物釋放實(shí)驗(yàn)，從圖5C中可知：在pH=7.4的條件下，在0～24 h內(nèi)5-FU含量不斷上升，24 h后釋放速度趨于平緩，最終釋放量為46.6%；而在pH=5.0時(shí)，藥物在前6 h內(nèi)快速釋放，然后也趨于平緩，最終釋放量較中性條件大大提升，達(dá)到64.8%，可能是由于5-FU藥物分子的N和O原子與介孔硅表面富含的羥基通過氫鍵結(jié)合，在中性環(huán)境下較為穩(wěn)定，而在酸性環(huán)境中，H+能跟氫鍵受體相結(jié)合，從而氫鍵被破壞，最終導(dǎo)致藥物分子更多的釋放。為進(jìn)一步考察光照條件對(duì)藥物釋放的影響，光照組在藥物釋放8 h后光照10 min再繼續(xù)測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在pH=7.4和5.0時(shí)，光照后5-FU釋放速度均有大幅度提高，pH=5.0增幅更大，最終釋放率也增高到約79.8%，這可能是因?yàn)楣庹諏?dǎo)致材料體系溫度升高，5-FU與介孔硅之間的氫鍵被大量破壞，作用力的減弱使藥物釋放率增大。實(shí)驗(yàn)表明在光照以及類似于腫瘤細(xì)胞所屬的酸性環(huán)境下(pH=5.0)，rGO/Fe3O4@mSiO2藥物載體具有較高的最終釋放量和較快的釋放速度，可有效提高到達(dá)腫瘤部位的藥物濃度，從而更有利于藥物發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖5 (A)rGO/Fe3O4@mSiO2的N2吸附等溫線;(B)5-FU被rGO/Fe3O4@mSiO2負(fù)載前 (a)、負(fù)載后 (b)的紫外吸收光譜;(C)避光與光照條件和不同pH值PBS中rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU釋放行為曲線Fig.5 (A)N2adsorption isotherms of rGO/Fe3O4@mSiO2;(B)UV absorption spectra of the 5-FU solution before(a)and after(b)loaded on the rGO/Fe3O4@mSiO2nanocomposites;(C)Release behaviors of 5-FU from rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU nanocomposites in PBS with different pH values without or with NIR laser irradiation for 10 min,respectively

2.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖6 不同濃度的rGO/Fe3O4@mSiO2和rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU在無光照 (A)和有光照(B)條件下培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞存活率Fig.6 Viability of HeLa cells incubated with different concentrations of rGO/Fe3O4@mSiO2and rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU without(A)and with(B)irradiation

通過細(xì)胞MTT測試，研究了rGO/Fe3O4@mSiO2和rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU在光照與否的條件下對(duì)細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖6所示。對(duì)無光照條件下的rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合物(圖6A)來說，細(xì)胞存活率隨著材料濃度的增加沒有顯著的變化，平均可達(dá)95%以上，說明rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合材料具有良好的生物相容性。無光照條件下的rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU，對(duì)細(xì)胞具有一定的殺傷效果，且在高濃度下更為顯著，主要是由于rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU高濃度釋放出的5-FU的化療作用。而在光照條件下(圖6B)，細(xì)胞的存活率均有不同程度的降低，是由于rGO/Fe3O4@mSiO2的光熱性能對(duì)細(xì)胞具有一定的殺傷效果。光照條件下的rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU，對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷效果則最為明顯，源于rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU載體材料中釋放出的5-FU的化療與光照條件下材料優(yōu)異的光熱性能的協(xié)同抗腫瘤作用。

2.7 細(xì)胞熒光顯微鏡圖像分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證rGO/Fe3O4@mSiO2作為藥物載體對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用，我們進(jìn)行了細(xì)胞熒光成像分析。圖7a為對(duì)照組，由圖可以看出，HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)出亮藍(lán)色熒光(a1)且無紅色熒光(a2)，這說明在此條件下HeLa細(xì)胞均處于存活狀態(tài)，無明顯死亡現(xiàn)象。當(dāng)在細(xì)胞中加入了rGO/Fe3O4@mSiO2時(shí)，仍無明顯紅色熒光(b2)出現(xiàn)，表明復(fù)合物具有良好的生物相容性。與之相比較，光照之后在部分區(qū)域呈現(xiàn)出微弱的紅色熒光 (d2)，說明在光照時(shí)rGO/Fe3O4@mSiO2優(yōu)異的光熱效應(yīng)引起局部溫度上升導(dǎo)致部分細(xì)胞壞死或凋亡。在rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU納米復(fù)合物存在下培養(yǎng)，可以看出細(xì)胞在無光照情況下出現(xiàn)較弱的紅色(c2)，是其負(fù)載的5-FU發(fā)揮了化療效果，而在光照條件下，出現(xiàn)了十分明顯的亮紅色熒光(e2)并擬合出紫紅色熒光(e3)，表明HeLa細(xì)胞大面積死亡，說明rGO/Fe3O4@mSiO2的光熱和5-FU的化療作用產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可大幅度提升殺死癌細(xì)胞的效果。

圖 7 培養(yǎng)基 (a)、rGO/Fe3O4@mSiO2(b,d)和 rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU(c,e)與HeLa細(xì)胞共孵育在無光照 (a～c)和有光照 (d,e)條件下的熒光顯微鏡圖Fig.7 Fluorescence microscopy images of HeLa cells incubated with nothing(a),rGO/Fe3O4@mSiO2(b,d)and rGO/Fe3O4@mSiO2-5-FU(c,e)without(a～c)and with irradiation(d,e)

3 結(jié) 論

通過各層之間靜電吸附作用制備了類似三明治結(jié)構(gòu)的rGO/Fe3O4@mSiO2納米復(fù)合材料，考察了其藥物負(fù)載與釋放能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rGO/Fe3O4@mSiO2能夠有效的裝載抗癌藥物5-FU，載藥率可達(dá)57.34%，并具有較高的藥物釋放量；產(chǎn)物中Fe3O4成分的存在，使得rGO/Fe3O4@mSiO2具有優(yōu)異的磁性，磁飽和強(qiáng)度為32 emu·g-1，可應(yīng)用于磁靶向藥物傳輸；而且，rGO/Fe3O4@mSiO2復(fù)合納米材料具有優(yōu)異光熱效應(yīng)，可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行光熱治療。因此，納米復(fù)合物rGO/Fe3O4@mSiO2是將磁靶向的Fe3O4、優(yōu)異光熱性能的rGO和生物相容性良好的mSiO2相結(jié)合，使其具備高效的藥物裝載能力以及化療、光熱療法協(xié)同抗腫瘤作用，將在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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