昝雪娟 榮冬蕓 潘軍玲 呂琳娜 肖露 曹煜

550000貴陽(yáng)，貴州醫(yī)科大學(xué)（昝雪娟、榮冬蕓、潘軍玲、呂琳娜、肖露）；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科（曹煜）

順鉑（diamine dichloro platinum）是臨床上廣泛應(yīng)用的化療藥物，單用或者聯(lián)合其他藥物可用于多種腫瘤的治療，但順鉑的劑量依賴(lài)性不良反應(yīng)和耐藥性是有效化療的主要障礙之一。大量研究表明，聯(lián)合化療，特別是傳統(tǒng)化療藥聯(lián)合中藥，對(duì)增加抗癌療效和減輕單藥不良反應(yīng)具有很大應(yīng)用價(jià)值［1?3］。姜黃揮發(fā)油（turmeric volatile oil，TVO）為姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longa L.）的主要提取物，具有抗炎、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用。TVO能有效抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱(chēng)鱗癌）A431細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡［4］。我們將TVO與順鉑聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的人皮膚鱗癌A431細(xì)胞，觀(guān)察其對(duì)A431細(xì)胞的抑制作用，探討其相互作用及抑癌機(jī)制，為T(mén)VO藥物開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料

TVO［貴陽(yáng)舒美達(dá)藥廠(chǎng)，批號(hào)：Z20025149，純度80%，規(guī)格25 g，將其與二甲基亞砜（DMSO）以100∶1的比例混合，用培養(yǎng)基稀釋成1 g/L，濾過(guò)除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?，注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號(hào)6M025A89，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021358，規(guī)格：10 mg），用DMEM高糖完全培養(yǎng)基將其稀釋為1 g/L，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?，A431細(xì)胞、CCK8試劑盒、DMEM高糖培養(yǎng)基、吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貴陽(yáng)凱信生物工程有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）?3、Caspase?9酶活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究院），ELX800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Biotech公司），兔抗人P糖蛋白單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），BD FACS Verse流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)A431細(xì)胞，每2～3天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底后，以0.25%胰蛋白酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：

（1）不同濃度TVO對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)431細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液（1×104/ml），接種于96孔板，每孔加100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，加入TVO，使終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80 mg/L；對(duì)照組加入含有1%DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK8試劑，孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（A450），細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組A450-實(shí)驗(yàn)組A450）/（對(duì)照組A450-空白組A450）×100%。采用Calacusyn軟件計(jì)算抑制細(xì)胞增殖50%的藥物濃度（IC50）。

（2）TVO與順鉑單獨(dú)或聯(lián)用對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)431細(xì)胞，按上述方法接種于96孔板，設(shè)對(duì)照組、TVO組、順鉑組及TVO+順鉑組。TVO組用40 mg/L TVO［根據(jù)“二、2（1）”實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇，對(duì)A431細(xì)胞作用最明顯且在IC50以下］處理，順鉑組用10 mg/L順鉑處理［5］，TVO+ 順鉑組用40 mg/L TVO和10 mg/L順鉑處理，對(duì)照組用含有1%DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按上述方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI），CI=Eab/（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea、Eb分別為單藥作用抑制率，Eab為T(mén)VO+順鉑組細(xì)胞的抑制率。CI＞ 1為協(xié)同，1為相加，＜ 1為拮抗［6］。

3.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：用完全DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)431細(xì)胞密度為1×106/ml，接種至6孔板，每孔2 ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，按“二、2（2）”分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

4.AO/EB雙染色熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞凋亡：用完全DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)431細(xì)胞密度為1×106/ml，接種到6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，按“二、2（2）”中分組處理細(xì)胞24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入AO/EB染液4℃避光染色15 min，吸棄染液，PBS洗滌，熒光顯微鏡觀(guān)察、拍照。

5.Caspase?3、Caspase?9 酶活性檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法同“二、2（4）”，處理24 h后，離心收集細(xì)胞，加入50 μl裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min，期間渦旋3～4次，12 000×g、4℃離心10～15 min，吸取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，37℃孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)處A值。Caspase?9（或Caspase?3）酶活性 = 實(shí)驗(yàn)組A405/對(duì)照組A405。

6.Caspase?3、P糖蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用 Western印跡法。按“二、2（4）”中分組處理24 h。收集細(xì)胞，PBS洗2次，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。將含有等量蛋白的細(xì)胞裂解液用5×上樣緩沖液稀釋?zhuān)糜谑榛蛩徕c聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗（1∶1 000）4℃過(guò)夜；加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1∶500）37℃孵育1 h，顯色液顯色后掃描成像。以β肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算并比較Caspase?3及P糖蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，同一時(shí)段不同濃度TVO組間比較采用單因素方差分析，聯(lián)合用藥組與單藥組間比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采樣LSD?t檢驗(yàn)；細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度間的關(guān)系采用直線(xiàn)相關(guān)分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TVO對(duì)A431細(xì)胞增殖抑制率的影響

A431細(xì)胞經(jīng)不同濃度TVO作用24 h后，5、10、20、40、80 mg/L TVO對(duì)A431細(xì)胞增殖抑制率分別是12.83% ±6.4%、16.27% ±11.4%、21.61% ±9.1%、33.11%±2.0%、46.00%±3.3%，與對(duì)照組（4.03%±1.4%）相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著TVO濃度增高，A431細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)關(guān)系（r=0.657，P＜0.05）。24 h時(shí)TVO的IC50為（61.66±1.03）mg/L。

二、TVO和順鉑對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響

A431細(xì)胞經(jīng)TVO或（和）順鉑作用24 h后，細(xì)胞增殖均受到不同程度抑制，TVO與順鉑聯(lián)用組與TVO組、順鉑組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。40 mg/L TVO與10 mg/L順鉑聯(lián)用后CI值為1.366。

三、TVO與順鉑對(duì)A431細(xì)胞形態(tài)的影響

TVO與順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用A431細(xì)胞24 h后，倒置顯微鏡觀(guān)察顯示，對(duì)照組A431細(xì)胞呈條索狀或多角形，貼壁生長(zhǎng)緊密，形態(tài)一致，均質(zhì)性，較透亮，折光性強(qiáng)，細(xì)胞排列均勻；TVO組貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞間隙略增大，部分呈長(zhǎng)梭形，部分細(xì)胞變圓，折光度下降；順鉑組貼壁細(xì)胞數(shù)量大量減少，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞皺縮、變圓，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多；TVO+順鉑組細(xì)胞已無(wú)正常細(xì)胞形態(tài)，單位面積細(xì)胞數(shù)明顯減少，出現(xiàn)小片狀無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)，部分細(xì)胞裂解成細(xì)胞碎片，并有大量漂浮細(xì)胞。

圖1 熒光顯微鏡下觀(guān)察各組A431細(xì)胞凋亡（×200） 1A：對(duì)照組細(xì)胞核較大，核膜完整；1B：姜黃揮發(fā)油組可見(jiàn)少量細(xì)胞核染色質(zhì)著黃色或橙黃色的早期凋亡細(xì)胞；1C：順鉑組可見(jiàn)大量黃色熒光和橘紅色熒光；1D：姜黃揮發(fā)油+順鉑組細(xì)胞密度下降，可見(jiàn)橘紅色壞死細(xì)胞及碎片

四、TVO與順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

見(jiàn)圖1。AO/EB雙染色觀(guān)察顯示，TVO與順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用A431細(xì)胞24 h后，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目較多，且為活細(xì)胞，核染色質(zhì)染成綠色，形狀均勻；TVO組部分細(xì)胞核染色質(zhì)染成黃色或橙黃色的早期凋亡細(xì)胞；順鉑組中可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)著橙黃色熒光的早期凋亡細(xì)胞和著橘紅色熒光的晚期凋亡細(xì)胞；TVO+順鉑組細(xì)胞密度明顯下降，可見(jiàn)大量細(xì)胞核染色質(zhì)呈橘紅色，并可見(jiàn)橘紅色壞死細(xì)胞及碎片。

表1 姜黃揮發(fā)油（TVO）和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)A431細(xì)胞增殖和Caspase?3、9活性以及Caspase?3蛋白和P糖蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 姜黃揮發(fā)油（TVO）和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)A431細(xì)胞增殖和Caspase?3、9活性以及Caspase?3蛋白和P糖蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=4；與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與TVO組相比，bP ＜0.05；與順鉑組相比，cP ＜0.05

組別對(duì)照組TVO組順鉑組TVO+順鉑組增殖抑制率（%）0.8±0.3 3.9±1.3a 23.3±7.6a 36.2±9.3a b c Caspase?3活性0.028±0.012 1.117±0.095a 1.381±0.089a 1.520±0.115a b c Caspase?9活性0.056±0.001 1.259±0.059a 1.829±0.171a 2.760±0.297a b c Caspase?3蛋白0.339±0.011a 1.156±0.006a 1.296±0.021a 1.482±0.016a b c P糖蛋白1.522±0.002a 1.311±0.011a 1.169±0.012a 0.528±0.014a b c

五、TVO 與順鉑對(duì) A431細(xì) 胞 Caspase?3、Caspase?9 活性的影響

TVO與順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用A431細(xì)胞24 h后，TVO組、順鉑組及TVO+順鉑組中A431細(xì)胞Caspase?3、Caspase?9 酶活性較對(duì)照組均增強(qiáng)，且TVO+順鉑組高于TVO組、順鉑組（均P＜0.01）。見(jiàn)表1。

六、TVO與順鉑對(duì)A431細(xì)胞Caspase?3、P糖蛋白表達(dá)的影響

見(jiàn)表1、圖2。TVO+順鉑組P糖蛋白表達(dá)量明顯低于TVO組、順鉑組，TVO+順鉑組Caspase?3表達(dá)量均明顯高于TVO組、順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 不同濃度姜黃揮發(fā)油（TVO）對(duì)A431細(xì)胞中P糖蛋白、Caspase?3蛋白表達(dá)的影響

討 論

順鉑是一種金屬鉑類(lèi)化合物，可結(jié)合癌細(xì)胞DNA，干擾其復(fù)制，達(dá)到破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能的效果。順鉑被公認(rèn)為是治療多種腫瘤（包括皮膚鱗癌）的一線(xiàn)用藥，但因其毒性大、易耐藥，在臨床上多以鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)制定聯(lián)合治療方案［7?9］。因此尋找能夠增敏順鉑且減輕其毒性和不良反應(yīng)的新型藥物有重要臨床意義。腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其中P糖蛋白的過(guò)度表達(dá)是引起多藥耐藥（MDR）的主要機(jī)制［10?11］。P糖蛋白由多藥耐藥基因mdr1編碼，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為170 000的跨膜糖蛋白（P170），位于細(xì)胞膜上，作為識(shí)別蛋白不停地篩查外來(lái)疏水分子，這些分子包括許多有害物質(zhì)，也包括一些很重要的物質(zhì)，如順鉑、環(huán)孢素等其他抗癌藥，它具有能量依賴(lài)性“藥泵”功能，可使細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。此外，P糖蛋白還可使細(xì)胞內(nèi)藥物再分布從而進(jìn)一步減少靶點(diǎn)部位藥物濃度［12］。P糖蛋白在腫瘤細(xì)胞耐藥株中的表達(dá)水平較普通細(xì)胞株顯著上調(diào)［13?14］，可使腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。近年有研究表明，P糖蛋白可能通過(guò)一些信號(hào)通路參與腫瘤MDR發(fā)生［15?16］，如抑制Fas系統(tǒng)，激活Caspase?8活性［17］，同時(shí)抑制線(xiàn)粒體膜電位下降［18］。此外，P糖蛋白還可直接進(jìn)行凋亡抑制，延遲凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制Caspase?3激活，進(jìn)而抑制Caspase依賴(lài)型凋亡［19］。還有研究顯示，活化的Caspase?3能通過(guò)分解DNA蛋白激酶來(lái)更加顯著地抑制DNA?PKcs/Akt/GSK?3β信號(hào)通路，從而降低P糖蛋白的表達(dá)［20］。

本研究結(jié)果顯示，隨著濃度增加，TVO對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，呈一定程度劑量依賴(lài)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)TVO能有效抑制人皮膚鱗癌A431細(xì)胞增殖［4］；同時(shí)，TVO與順鉑聯(lián)用對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于TVO或順鉑單用，兩藥具有明顯的協(xié)同作用。而且，TVO+順鉑組凋亡、死亡細(xì)胞明顯增加，多無(wú)正常細(xì)胞形態(tài)，Caspase?3和Caspase?9活性升高，由于Caspase?9是線(xiàn)粒體通路凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，提示線(xiàn)粒體通路參與凋亡過(guò)程。TVO+順鉑組P糖蛋白表達(dá)明顯降低，而Caspase?3蛋白表達(dá)明顯增加，提示TVO可能通過(guò)降低P糖蛋白的表達(dá)或影響其功能，同時(shí)誘導(dǎo)Caspase?3激活，抑制A431細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生MDR，促進(jìn)順鉑誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。

總之，TVO不僅自身可抑制A431細(xì)胞增殖，與順鉑可以發(fā)揮協(xié)同抗A431細(xì)胞作用，其可能是通過(guò)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑發(fā)揮作用，與活化Caspase系統(tǒng)及降低P糖蛋白表達(dá)相關(guān)，但確切的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

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