孫倩 楊麗君 周歡琴★

雙氫青蒿素（DHA）是青蒿素的衍生物，是從天然藥物青篙中提取的。DHA是一類臨床奏效快，治愈率高且毒性低的抗瘧疾藥物，尤其對易耐藥的腦型瘧、惡性瘧有效。研究表明，DHA對于各種腫瘤細胞系的癌癥，還具有抗腫瘤活性，能促使腫瘤細胞凋亡［1-2］。然而，DHA治療惡性腫瘤方面也存在一些問題，例如在溶液中或血液中溶解度差，生物利用度低，口服活性不佳，血漿半衰期短，從而導致在治療過程中使用劑量和次數(shù)的增加［3-4］?？梢酝ㄟ^制備DHA納米微粒來增加DHA體外溶出度，延長釋放時間，提高其生物利用率，解決DHA單獨給藥時存在的問題。在前期研究中，作者開發(fā)了靜電場系統(tǒng)制備生物聚合物納米顆粒的方法［5］。本實驗采用的肺腺癌A549細胞是目前肺癌研究常用的一種肺腺癌細胞系，通過制備納米微粒作為載體來包覆DHA，探討DHA的生物聚合物納米微粒的理化性質(zhì)以及對人肺腺癌A549細胞凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人肺腺癌A549細胞株由臺灣義守大學生物醫(yī)學工程系提供，雙氰青蒿素購自Sigma-Aldrich公司，其他化學試劑包括海藻酸鈉、明膠、胎牛血清和二甲基亞砜等均購自Gibco生命科技有限公司。實驗涉及的溶液均由去離子水配制。采用透射電鏡（G2 20 S-Twin，Tecnai，USA）觀察納米微粒的形貌，測算納米微粒的粒徑；采用高效液相色譜儀（1100series，Agilent，USA）檢測DHA濃度，使用C-18色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相為40%的乙腈和60%的去離子水，流速設(shè)定為1ml/min，柱溫為35℃，檢測波長為210nm。

1.2 納米微粒的制備 （1）生物聚合物納米微粒的制備：采用靜電場系統(tǒng)制備四種生物聚合物納米微粒（Chitosan-alginate，Chitosan-NaOH，Gelatin和 HA納米微粒）。（2）包覆DHA的生物聚合物納米微粒的制備：在996 μl的四種生物聚合物溶液中加入4 μl配制好的25mg/ml DHA溶液，使得DHA的最終濃度為100μg/ml，采用靜電場系統(tǒng)制備包覆DHA的納米微粒。

1.3 細胞活性測試 （1）納米微粒的體積和種類的篩選：分別置放10μl、20μl、30μl和40μl四種未包覆DHA的納米微粒與已培養(yǎng)1d的A549細胞共同培養(yǎng)1d后，加入20μl MTT，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光值，篩選納米微粒的體積和種類。（2）HA-DHA納米微粒細胞活性測試：設(shè)置HA-DHA納米微粒、DHA、HA納米微粒和DMSO四個組別，分別與已培養(yǎng)1d的A549細胞培養(yǎng)1d、2d、3d后，加入MTT試劑檢測其吸光值。

1.4 細胞凋亡測試 設(shè)置HA-DHA納米微粒、DHA、HA納米微粒和DMSO四個組別，與已培養(yǎng)1d的A549細胞爬片共同培養(yǎng)2d后，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒提供的方法進行染色并在熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電子顯微鏡（TEM） 圖通過TEM觀測其形貌，圖1分別是Chitosan-Alginate、Chitosan-NaOH、Gelatin和HA四種納米微粒的TEM圖。Chitosan-Alginate，Gelatin和HA納米微粒分布均勻，大小均一且球形規(guī)律；Chitosan-NaOH粒徑大小均一性較差。圖2是生物聚合物包覆DHA形成的納米微粒TEM圖。Chitosan-Alginate-DHA和 Chitosan-NaOH-DHA納米微粒分布均勻且大小均一；Gelatin-DHA和HADHA納米微粒則出現(xiàn)了顆粒團聚現(xiàn)象。表1為四種納米微粒包裹前后的粒徑大小。Chitosan納米微粒在包覆DHA前后粒徑大小并無明顯區(qū)別，粒徑大小都在3～10nm之間，而HA和Gelatin在包覆DHA前后粒徑大小相差較多，Gelatin和HA 納米微粒粒徑分別為（4.3±0.98）nm和（17.7±5.5）nm；包覆DHA后，粒徑分別變?yōu)椋?9.4±6.9）nm和（29.5±9.8）nm。

圖1 四種生物聚合物納米微粒的TEM圖［（a）Chitosan納米微粒（交聯(lián)劑為Alginate）；（b）Chitosan納米微粒（交聯(lián)劑為NaOH）；（c）Gelatin納米微粒；（d）HA納米微粒］

表1 四種納米微粒包裹前后的粒徑大小（±s）

表1 四種納米微粒包裹前后的粒徑大?。ā纒）

Chitosan-alginate Chitosan-NaOH Gelatin HA納米微粒粒徑大?。╪m）包覆DHA前 6.24±1.12 7.51±2.18 4.3±0.98 17.7±5.5包覆DHA后 4.24±0.92 6.27±1.34 39.4±6.9 29.5±9.8

2.2 包覆率測試 DHA的含量可由HPLC測定，根據(jù)建立的標準曲線可以計算實驗中DHA的含量。表2是不同的生物聚合物納米微粒對DHA包覆率。四種納米微粒的包覆率的大小順序為：HA-DHA（35%）＞Chitosan-NaOH-DHA（21%）＞Chitosan-Alginate-DHA（18%）＞Gelatin-DHA（13%）。

圖2 包裹DHA的納米微粒的TEM圖［（a）Chitosa- Alginate-DHA；（b）Chitosan-NaOH-DHA；（c）Gelatin-DHA納米微粒；（d）HA-DHA納米微粒］

表2 納米微粒包覆DHA的包覆效率（±s）

表2 納米微粒包覆DHA的包覆效率（±s）

包覆DHA納米微粒組 包覆率（%）Chitosan-alginate-DHA 18.227±1.262 Chitosan-NaOH-DHA 20.904±1.275 Gelatin-DHA 12.915±2.410 HA-DHA 35.320±5.827

2.3 細胞活性檢測 （1）納米微粒放置濃度篩選：納米微粒包覆DHA的抗癌藥性是通過將包覆DHA的納米微粒與人肺腺癌A549細胞共同培養(yǎng)，加入MTT試劑后通過酶標儀檢測其OD值來反應DHA對A549細胞的毒殺作用。實驗中通過加入不同體積的納米微粒懸浮液（10μl，20μl，30μl和 40μl）與 A549 細胞共同培養(yǎng)，來檢測四種納米微粒對人類細胞無毒殺作用。加入10 μl兩組Chitosan納米微粒懸浮液與A549細胞共培養(yǎng)時，與對照組比較，A549細胞的存活率明顯降低；經(jīng)統(tǒng)計學分析其與比較控制組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。20μl的Gelatin納米微粒懸浮液即可引起細胞活性降低；而HA納米微粒在加入40 μl時才會導致細胞凋亡，經(jīng)統(tǒng)計學分析其與比較控制組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，選擇加入10 μl體積的HA納米微粒懸浮液與細胞作用進行以下實驗。（2）包覆DHA納米微粒的細胞活性測試：選擇HA納米微粒進行細胞活性測試，DHA對照組的濃度是最小致細胞凋亡的濃度為10μg/ml。與A549細胞作用后，HA-DHA納米微粒明顯降低了A549細胞活性，而且隨著培養(yǎng)時間的增加，A549細胞活性的降低程度越大。HA-DHA納米微粒比直接加入DHA更有效地引起細胞凋亡，經(jīng)統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 細胞凋亡測試 為了研究納米微粒包覆DHA前后對人肺腺癌A549細胞的凋亡作用，將細胞處理作用2d后，將細胞爬片進行Annexin V-FITC染色以及PI染色，在光學顯微鏡和熒光顯微鏡下進行觀察。DHA與A549細胞共培養(yǎng)2d后，出現(xiàn)細胞收縮、偽足萎縮、細胞膜皺縮、細胞從爬片上脫落的現(xiàn)象，這是細胞凋亡的典型形態(tài)學改變。在細胞中加入HA-DHA納米微粒共培養(yǎng)時也出現(xiàn)了細胞凋亡現(xiàn)象，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色和紅色熒光信號，表明細胞出現(xiàn)了早期凋亡和死亡。然而HA納米微粒組細胞仍與控制組保持相似的細胞結(jié)構(gòu)，并且細胞良好地貼覆在玻片上。染色結(jié)果證實了DHA和HA-DHA對A549細胞的凋亡作用，綠色的熒光信號表示細胞早期凋亡，紅色的熒光信號表示細胞晚期凋亡或者死亡。

3 討論

DHA是ART的一個衍生產(chǎn)物，對人類癌癥細胞表現(xiàn)出抑制作用。已有研究表明DHA能夠誘導人肺腺癌A549細胞凋亡［6］，本研究采用生物聚合物納米微粒，將DHA包覆于其中，從而改善DHA應用上的弊端。選用的Chitosan，Gelatin，HA作為納米微粒的主要材料，是因為其具有良好的生物相容性，生物降解性和水溶性，在制備過程中不需要加入任何有機溶劑，從而夠改善DHA在水相中難以溶解均勻分布的特點。

本研究結(jié)果顯示，包覆DHA后，Chitosan-Alginate-DHA和Chitosan-NaOH-DHA納米微粒分布均勻且大小均一，未出現(xiàn)顆粒團聚現(xiàn)象，推測是納米微粒具備雙極性的特征：Chitosan帶正電荷，而Alginate帶負電荷，NaOH在酸性條件下有較多的氫氧根。在這種雙極性的條件下，生物聚合物溶液的乳化作用較強，即能有效地分散油溶性DHA，但由于受到配制條件的限制而呈酸性，與細胞共培養(yǎng)時，降低了細胞活性導致細胞死亡。Gelatin-DHA和HA-DHA納米微粒由于DHA屬于油溶性藥物，與水溶性Gelatin和HA的連接性不強，出現(xiàn)了顆粒團聚現(xiàn)象。MTT細胞活性測試和熒光染色結(jié)果顯示，HA-DHA納米微粒中比單純加入DHA更能增強DHA的生物利用度和A549細胞凋亡的作用。

細胞膜是防止細胞外物質(zhì)自由進入細胞的屏障，其主要通過細胞內(nèi)吞［7］作用包括胞飲作用、細胞吞噬作用與外界物質(zhì)交流。內(nèi)吞作用有四個基本機制：網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用，小穴蛋白介導的內(nèi)吞作用，不依賴網(wǎng)格蛋白和小穴蛋白的內(nèi)吞作用，巨胞飲［8］，納米微粒也是經(jīng)由細胞內(nèi)吞途徑進入細胞內(nèi)，此次研究中并未探討DHA進入A549細胞的方式。

綜上所述，納米微粒包覆DHA的方式比單純加入DHA更能誘導A549細胞進入凋亡的途徑。

［1］ Tan WF,Shen F,Luo XJ,et al．Artemisinin inhibits in vitro and in vivo invasion and metastasis of human hepatocellular carcinoma cells．Phytomedicine,2011,18(2-3):158-162．

［2］ Oda D,Habte T,Yamachika E．Artemisinin:an alternative treatment for oral cancer．Oral Surgery,Oral Medicine,Oral Pathology,Oral Radiology,and Endodontology,2004,98(2):204．

［3］ He Q,Sheikh MS,Huang Y,et al．Dihydroartemisinin upregulates death receptor 5 expression and cooperates with TRAIL to induce apoptosis in human prostate cancer cells．Cancer Biology & Therapy,2010,9(10):819-824．

［4］ Kong R,Cheng ZX,Wang YW,et al．Dihydroartemisinin enhances Apo2L/TRAIL-mediated apoptosis in pancreatic cancer cells via ROS-mediated up-regulation of death receptor 5．Plos One, 2012,7(5):e37222．

［5］ Chen H,Sun B,Pan SH,et al．Study on anticancer effect of dihydroartemisinin on pancreatic cancer．Zhonghua Wai Ke Za Zhi［Chinese journal of surgery］,2009,47(13):1002-1005．

［6］ 陳衛(wèi)強,戚好文,吳昌歸,等．雙氰青蒿素抗人肺腺癌A549細胞生長的實驗研究．中國肺癌雜志,2005,8(2):85-88．

［7］ 范真真,陳虹,黃秉仁．細胞內(nèi)吞的研究進展．生命的化學,2014,34(4):492-499．

［8］ Harush-Frenkel O,Oshrat N,Simon B,et al．Targeting of nanoparticles to the clathrin-mediated endocytic pathway．Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,353(1):26-32．