藍(lán)永生　侯廣慶　張鏡宇　蔣艷杰　張殿禹　汪　波

(長春師范大學(xué)體育學(xué)院，吉林　長春　1130032)

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科

骨密度是臨床診斷骨質(zhì)疏松和反映骨骼健康狀況的重要指標(biāo)，體育運(yùn)動(dòng)是提高骨密度的有效方法〔1～3〕，臨床上常被用作預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的替代療法〔4〕。在我國被廣泛推廣的運(yùn)動(dòng)方式主要包括力量訓(xùn)練、有氧運(yùn)動(dòng)和有氧加力量混合運(yùn)動(dòng)。力量訓(xùn)練能夠促進(jìn)骨骼重建，顯著提高骨密度〔5〕。有氧運(yùn)動(dòng)能抑制破骨細(xì)胞活性〔6〕，減緩骨礦物質(zhì)流失。本研究探討不同強(qiáng)度的有氧加力量混合運(yùn)動(dòng)對大鼠骨密度的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組18月齡雄性Wistar大鼠32只，飼養(yǎng)于長春師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，自由采食、進(jìn)水。動(dòng)物被隨機(jī)分成4組各8只。其中3組將以負(fù)重爬坡跑方式模擬有氧加力量混合運(yùn)動(dòng)。根據(jù)負(fù)重重量將3組分為小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SL組)，體重(237±12.25)g；中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(ML組)，體重為(238±12.46)g；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(HL組)，體重(237±12.38)g；余1組為對照組，體重(235±9.29)g。各組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2運(yùn)動(dòng)器械與方案動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。期間SL組，ML組和HL組進(jìn)行5 d適應(yīng)性訓(xùn)練，第1～4天訓(xùn)練方案為坡度為0°，速度為15 m/min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，時(shí)間由20 min逐漸過渡到30 min。正式訓(xùn)練方案參考訓(xùn)練方法〔7〕：SL組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)加無負(fù)重跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，ML組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)加5%體重跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，HL組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)+10%體重跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。負(fù)重方式以大鼠要背負(fù)施加重物方式實(shí)現(xiàn)，負(fù)重重量根據(jù)體重每周調(diào)整1次。跑臺(tái)坡度為5°，跑速為15 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30 min。第一天正式訓(xùn)練后即刻眼內(nèi)眥取血，乳酸儀測血乳酸。運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠血乳酸含量：對照組為(1.1±0.1)mmol/L，SL組為(3.0±0.2)mmol/L，ML組為(3.4±0.2)mmol/L，HL組為(3.7±0.2)mmol/L。血乳酸濃度均<4.0 mmol/L，說明機(jī)體代謝類型以有氧氧化為主〔8〕，滿足實(shí)驗(yàn)要求。此方案持續(xù)8 w，每周運(yùn)動(dòng)5 d(周一至周五)。對照組正常飼養(yǎng)，無需運(yùn)動(dòng)。

1.3骨密度測量用10%水合氯醛，每100 g大鼠體重腹腔注射0.003 ml麻醉動(dòng)物后，用美國產(chǎn)Norland XR-800骨密度儀測量全身骨密度。

1.4實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測取左腿股骨在預(yù)冷研缽中加入液氮研磨。用Trizol試劑盒提取總RNA，Nanodrop 2000測OD260 nm/280 nm，計(jì)算mRNA濃度和純度。應(yīng)用PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，檢測Wnt家族分泌蛋白(Wnt)3a，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2和堿性磷酸酶(ALP)的mRNA水平。PCR反應(yīng)體系為Wnt3a上游：5′-TATGTCAGCTGCCAGGAGTG-3′、下游：5′- GACCCTTCCGAGTAGGAACC-3′。β-catenin上游：5′-GCCAG-TGGATTCCGTACTGT-3′、下游：5′-GAGCTTGCTTTCCTGATTGC-3′。GAPDH上游：5′-TGCTGAGT-ATGTCGTGGAG-3′、下游：5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′。Runx2上游：5′-AAGTGCGGTGCAAACTTTCT-3′、下游：5′-ACGCCATAGTCCCTCCTTTT-3′。ALP上游：5′-GACCTTGAAAAATGCCCTGA-3′、下游：5′-CTTGGAG-AGAGCCACAAAGG-3′。95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)　果

2.18 w后各組全身骨密度變化8 w后骨密度儀掃描結(jié)果顯示ML組〔(0.19±0.02)g/cm2〕和HL組骨密度〔(0.20±0.02)g/cm2〕較對照組〔(0.17±0.01)g/cm2〕有顯著提高(P=0.032,P=0.07)，但SL組骨密度〔(0.18±0.01)g/cm2〕沒有變化。

2.28 w后各組Wnt3a、β-catenin、Runx2、ALP mRNA水平變化3個(gè)運(yùn)動(dòng)組Wnt3a和β-catenin mRNA水平較對照組均有顯著升高(P<0.001)，ML組和HL組Runx2、ALP mRNA水平較對照組有顯著提升(P<0.001)。見表1。

表1　8 w后各組Wnt3a、β-catenin、Runx2、ALP mRNA水平變化

與對照組比較：1)P=0.000

3　討　論

有氧加力量混合運(yùn)動(dòng)有兩種形式：①兩者分別練習(xí)。此種形式需分別控制有氧運(yùn)動(dòng)和力量訓(xùn)練的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間等因素，對運(yùn)動(dòng)過程監(jiān)控要求嚴(yán)格，更適合有運(yùn)動(dòng)經(jīng)驗(yàn)的人進(jìn)行。②兩者同時(shí)練習(xí)。此種運(yùn)動(dòng)形式是在有氧運(yùn)動(dòng)同時(shí)加入力量訓(xùn)練元素，只需將運(yùn)動(dòng)時(shí)血乳酸濃度控制在4.0 mmol/L以內(nèi)即可，運(yùn)動(dòng)執(zhí)行簡單，適合在大眾人群中普及。本研究說明有氧+力量混合運(yùn)動(dòng)可能是通過刺激成骨細(xì)胞分化提高骨密度。Wnt/β-catenin信號通路是促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的關(guān)鍵機(jī)制。Wnt/β-catenin信號通路是促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的關(guān)鍵機(jī)制。Wnt/β-catenin信號通路的主要由Wnt家族分泌蛋白(Wnts)，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6，β-catenin，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子(LEF)等組成。當(dāng)Wnts蛋白出現(xiàn)時(shí)，可與細(xì)胞膜表面的LRP5/6結(jié)合，抑制β-catenin蛋白磷酸化，使β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)堆積，當(dāng)β-catenin蛋白達(dá)到一定含量后，便進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)。Runx2是Wnt/β-catenin信號通路刺激表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一，可調(diào)控成骨細(xì)胞分化〔9〕。本研究認(rèn)為有氧+力量混合運(yùn)動(dòng)可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，刺激Runx2表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而提高骨密度。

本研究說明血乳酸濃度≥3.4 mmol/L的有氧+力量混合運(yùn)動(dòng)對骨密度有顯著促進(jìn)作用。但需強(qiáng)調(diào)的是運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不是影響骨密度的唯一因素，還需考慮運(yùn)動(dòng)方式和鍛煉人群。研究發(fā)現(xiàn)在純有氧運(yùn)動(dòng)方式下，即使血乳酸濃度接近乳酸閾水平(4.0 mmol/L)依然不能提高絕經(jīng)后女性骨密度〔10〕。這主要是因?yàn)殄憻捜巳号c運(yùn)動(dòng)方式不匹配造成的。絕經(jīng)后女性雌激素水平急劇下降，骨礦物含量加速流失，骨密度總體呈降低趨勢。但有氧運(yùn)動(dòng)只能使骨量減少的趨勢得到緩解，而無法逆轉(zhuǎn)。因此不同人群應(yīng)首先根據(jù)自身生理特點(diǎn)選擇恰當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)方式，然后根據(jù)健身目的選擇合適的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，才會(huì)達(dá)到理想效果。

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4Giangregorio L,Papaioannou A,Macintyre N,etal.Too fit to fracture: exercise recommendations for individuals with osteoporosis or osteoporotic vertebral fracture〔J〕.Osteop Int,2014;25(3):821-35.

5Menkes A,Mazel S,Redmond R,etal.Strength training increases regional bone mineral density and bone remodeling in middle-aged and older men〔J〕.J App Physiol,1993;74(5):2478-84.

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7于淼,藍(lán)永生.有氧+力量混合運(yùn)動(dòng)預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用研究〔J〕.科技資訊,2017;15(1):196.

8Heck H,Mader A,Hess G,etal.Justification of the 4-mmol/L lactate threshold〔J〕.Int J Sports Med,1985;6(3):117-30.

9Hamidouche Z,Hay EP,Vaudin P,etal.FHL2 mediates dexamethasone-induced mesenchymal cell differentiation into osteoblasts by activating Wnt/β-catenin signaling-dependent Runx2 expression〔J〕.FASEB J,2008;22(11):3813-22.

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