武瑾，趙鵬，姜棋予，馬燕，張木子荷，李樹，王威，郭妤姝

1.解放軍總醫(yī)院 第六醫(yī)學中心藥劑科，北京100048；2.內蒙古軍區(qū)衛(wèi)生防疫隊，內蒙古 呼和浩特010051；3.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學中心臨床研究管理中心，北京100039；4.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心消化內科，北京100853；5.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學中心藥學部，北京100039

我國肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率占全球一半以上，有效治療HCC 是目前臨床診療面臨的巨大挑戰(zhàn)[1]。HCC 存在對傳統(tǒng)細胞毒性化療藥物系統(tǒng)性化療（口服或靜脈滴注）多藥耐藥特性（multidrug resistance，MDR），這極大地限制了HCC 抗腫瘤藥物的治療效果。同時，HCC 的治療仍以口服分子靶向藥物為主，這樣的給藥途徑造成藥物在患者的全身分布，一方面HCC 病變部位有效濃度有限，另一方面也會帶來對身體各臟器的毒副作用[2]。對HCC 的精準給藥和局部緩釋將可避免上述問題。隨著影像學技術的發(fā)展，CT 引導下經皮穿刺給藥或B 超引導下TACE 治療（transcatheter arterial chemoemboliza?tion）能夠實現(xiàn)藥物的精準給藥，載藥微球的精準給藥更可實現(xiàn)局部緩釋，為HCC 的治療提供了新的思路[3-4]。

載藥微球劑型具有諸多優(yōu)點，能夠實現(xiàn)化療藥物的靶向、緩釋作用，提高藥物的穩(wěn)定性[5]，同時該劑型的栓塞特性可配合TACE 精準治療，是目前抗腫瘤治療策略的研究熱點之一，值得深入研究[6]。然而載藥微球實驗研究的動物模型仍存在不足，主要體現(xiàn)在：載藥微球的肌肉注射與皮下注射與肝臟的清除代謝不符，不能正確反映藥物作用及清除率；小鼠肝臟體積小，不能實現(xiàn)肝臟原位腫瘤內給藥；大型動物價格昂貴，且較難建立HCC 模型。因此，建立能夠實施腫瘤精準給藥的大鼠肝臟原位腫瘤模型顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫缺陷裸鼠3 只（BALB/c Nude）與免疫缺陷大鼠12 只（Nude Rats）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；MHCC-97H 細胞由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心馮帆博士惠賜；載藥微球及阿霉素均為蘇州恒瑞迦俐生生物醫(yī)藥科技有限公司產品；索拉非尼（sorafenib）為Selleck 公司產品；胎牛血清（FBS）和DMEM 高糖培養(yǎng)基等細胞培養(yǎng)試劑購自Hyclone 公司；其余試劑均為國產分析純試劑；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等購自Corning 公司；PET/CT 小動物活體成像系統(tǒng)、蓋革計數(shù)器、小動物B 超由解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心提供；小動物吸入麻醉機及手術器械由本實驗室提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

人高侵襲肝癌細胞系MHCC-97H 用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 免疫缺陷小鼠皮下成瘤實驗

用PBS 重懸MHCC-97H 細胞，接種于免疫缺陷小鼠兩側腋下及兩側腹股溝，經過2 周生長后收集皮下腫瘤組織進行后續(xù)實驗。

1.4 免疫缺陷大鼠肝臟原位成瘤實驗

剝取小鼠皮下腫瘤表面性狀較好的部分，制備成組織微塊（1 mm3），接種至大鼠肝臟原位，經過2 周生長后超聲波檢測肝臟腫瘤生長情況，待大鼠肝臟形成明確腫瘤病灶后進行后續(xù)實驗。

1.5 免疫缺陷大鼠肝臟腫瘤原位給藥

按廠商說明書制備阿霉素載藥微球，將載藥微球與10 mg/mL 阿霉素按1∶5 的比例混合，室溫下振蕩2 h，直至溶液變?yōu)橄鄬\色，此時的載藥量約為50 mg/mL，在已成瘤動物模型的肝臟腫瘤部位開腹給藥，在腫瘤組織內注射藥物，每組3只。對照組給予50 mg/mL 阿霉素溶液。阿霉素與索拉非尼聯(lián)用組：開腹注射阿霉素后連續(xù)3 d給予3 mg/kg 索拉非尼口服灌胃給藥治療。溶劑組給予注射用水。

1.6 阿霉素微球在組織內的清除檢測

在系列時間點尾部采血收集大鼠血液標本，按照文獻方法[7-8]采用液-質聯(lián)用技術測定血液中的阿霉素濃度，繪制阿霉素的體內清除曲線。

1.7 肝臟原位腫瘤生長狀態(tài)檢測

給藥1～2 周后，對大鼠進行PET/CT 小動物活體成像。動物吸入麻醉，每只動物經尾靜脈注射200 μCi18F-FDG 核素探針，40～50 min 后行PET/CT 檢測[9]，用蓋戈計數(shù)器進行量化分析；最后解剖收集動物肝臟拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

單因素方差分析比較x±s，使用SPSS 24.0 軟件，并計算P值。

2 結果

2.1 阿霉素載藥微球制備及緩釋特性檢測

如圖1A、B 所示，載藥微球經涂片后在鏡下呈白色微球狀，與阿霉素注射液孵育后呈紅色微球狀。圖1C 為阿霉素載藥微球的體內釋放情況。在大鼠肝臟原位腫瘤組織內注射阿霉素溶液或阿霉素載藥微球后，阿霉素溶液注射組動物血藥濃度在24 h 左右即達頂峰，血藥濃度水平最高為246 ng/mL，72 h 左右即清除完畢，阿霉素的血藥濃度低于檢測下限；而阿霉素載藥微球組的血藥濃度水平最高僅為57 ng/mL，注射后9 d 仍能檢測到阿霉素的分布。這表明，在大鼠原位肝臟腫瘤模中注射阿霉素載藥微球能夠實現(xiàn)阿霉素在腫瘤組織內的緩釋作用，大鼠肝臟腫瘤模型能夠模擬在肝臟臟器內的HCC 病灶，實現(xiàn)藥物在腫瘤組織內的精準給藥研究。

2.2 單次給予阿霉素載藥微球即可抑制大鼠肝臟原位腫瘤的生長

如圖2A，PET/CT 活體成像的結果與腫瘤組織照片均顯示在大鼠肝臟腫瘤內原位單次注射阿霉素載藥微球即可抑制HCC 細胞在大鼠肝臟原位的生長，而單次注射阿霉素溶液則不具有抗腫瘤作用。PET/CT 活體成像與腫瘤組織照片還表明，與單獨注射阿霉素載藥微球相比，口服灌胃給予索拉非尼聯(lián)合腫瘤組織內注射阿霉素載藥微球對大鼠肝臟原位HCC 腫瘤組織的抑制作用更為明顯（圖2B）。PET/CT 信號強度數(shù)值為肝臟信號與血液信號比值，計算抑制率（圖2C）。這表明，單次給予阿霉素載藥微球即可抑制大鼠肝臟原位腫瘤的生長，單次給予阿霉素載藥微球并給予大鼠口服灌胃分子靶向藥物索拉非尼能夠實現(xiàn)更好的抗腫瘤效果，模擬不同藥物治療策略的聯(lián)合作用。

圖1 阿霉素載藥微球與體內清除曲線

3 討論

本研究在免疫缺陷小鼠皮下腫瘤模型的基礎上建立了免疫缺陷大鼠的肝臟原位腫瘤模型，利用市售的載藥微球制備阿霉素載藥微球（江蘇恒瑞公司的產品已在臨床診療中得到廣泛應用），實現(xiàn)了阿霉素載藥微球在腫瘤組織內的精準給藥。在大鼠肝臟腫瘤組織內注射藥物后進行檢測，確定了單次給予阿霉素載藥微球既能夠實現(xiàn)阿霉素在腫瘤組織內部的長期存留及長效抗腫瘤作用，與索拉非尼聯(lián)用時更可有效抑制腫瘤的生長，模擬臨床診療中不同藥物治療策略的聯(lián)合使用。該動物模型的建立，將為精準給藥相關研究及代謝性質研究等提供諸多便捷：①與小鼠相比，大鼠的肝臟較大，便于以開腹或微創(chuàng)方式對肝臟進行精準注射，或在B 超引導下對肝臟原位瘤塊進行精準給藥，且在給藥劑量上將會有更多的選擇；②大鼠血液總量較大，可增加時間點，多次尾部采血，進行藥物代謝性質的檢測；③不同于肺癌等動物模型，位于肝臟的HCC 對葡萄糖的攝取明顯高于其他組織，可使用小動物PET進行檢測，通過PET 信號強度反應HCC 的活性及大小。總之，大鼠肝臟原位腫瘤模型解決了目前精準給藥及緩釋特性研究缺少動物模型的短板，是相關研究的理想的動物模型。

圖2 阿霉素載藥微球抑制大鼠肝臟原位腫瘤生長

阿霉素是廣譜抗腫瘤藥，臨床主要作為化療藥靜脈推注，然而隨著精準醫(yī)療的發(fā)展，為降低現(xiàn)有化療藥及分子靶向藥的不良反應，利用新型制劑技術制成的阿霉素載藥微球體現(xiàn)了新劑型抗腫瘤藥物的發(fā)展方向[10]。為延緩及降低腫瘤細胞多藥耐藥的發(fā)生，提高化療藥物和分子靶向藥物的療效，本實驗聯(lián)用阿霉素微球與索拉非尼對HCC 進行精準給藥，實驗結果顯示上述藥物聯(lián)用可更有效抑制腫瘤生長。

目前臨床上已有射頻消融治療（radio fre?quency ablation，RFA）與載藥微球聯(lián)用的治療策略，大鼠肝臟原位腫瘤動物模型能夠為該治療策略提供更好的實驗數(shù)據(jù)支撐及治療方式的改進，同樣該動物模型也可模擬其他手術類型如開腹手術、腔鏡引導下手術等。綜上所述，本研究建立了大鼠原位肝臟腫瘤的動物模型，驗證了其生物學活性，為相關研究奠定了基礎，突破了腫瘤精準治療缺少動物模型的壁壘，具有實用且廣闊的應用前景。