王琳琳，姜棋予，秦萌萌，馬壯

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽110016；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心，北京100039

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺部腫瘤最主要的病理類型，受限于現(xiàn)有臨床診療策略，大部分NSCLC 患者初診即為進(jìn)展期，失去了接受外科手術(shù)切除等根治性治療的機(jī)會[1]。目前，分子靶向藥物在進(jìn)展期NSCLC 治療中具有重要意義[2]。近年來，作用于血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）等靶標(biāo)的分子靶向藥物獲批上市，進(jìn)入NSCLC 的臨床診療[3]。這些藥物不僅為患者提供了更多選擇，也拓展了對NSCLC分子靶向治療的認(rèn)識。盡管研究取得了諸多進(jìn)展，但分子靶向治療仍存在治療費(fèi)用昂貴、易于出現(xiàn)藥物耐受等問題。因此，闡明分子靶向治療耐受的分子機(jī)制，探索新的藥物增敏干預(yù)靶標(biāo)具有重要意義。為深入研究新型分子靶向藥物對NSCLC 的殺傷作用，我們選取了最近獲準(zhǔn)上市的新型多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑侖伐替尼（樂伐替尼，lenvatinib）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)特征為螺旋-回環(huán)-螺旋以及PAS 結(jié)構(gòu)域[4]。以往研究認(rèn)為AhR 對機(jī)體有保護(hù)作用，能夠識別具有多環(huán)-稠環(huán)結(jié)構(gòu)特征的芳香烴等化合物或環(huán)境污染物。這些化合物種類多樣，包括平面芳香族（芳基）烴類、2，3，7，8-四氯二苯并二噁英以及多氯化聯(lián)苯等[5]。當(dāng)人體通過皮膚接觸或飲食、空氣污染等攝入這些物質(zhì)時(shí)，AhR 就能夠被識別與活化，開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄。近年的研究顯示，AhR 是藥物耐受的新型調(diào)控因子，通過介導(dǎo)下游基因的表達(dá)發(fā)揮藥物耐受的作用[6]。AhR 能夠介導(dǎo)細(xì)胞色素氧化酶P450家族CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1 亞型，人乙醛脫氫酶3 家族成員A1（ALDH3A1），UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A2 亞型（UGT1A2），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A1（GSTA1）等基因表達(dá)，這些基因產(chǎn)物能夠作為Ⅰ相或Ⅱ相藥物代謝酶降解與清除抗腫瘤藥物，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[7]。AhR 在肺癌組織、細(xì)胞中表達(dá)較高[8]，但其在肺癌發(fā)生與進(jìn)展中作用的報(bào)道較少，具體調(diào)控機(jī)制也不完全清楚。

為確定AhR 對NSCLC 細(xì)胞抗腫瘤藥物耐受的影響，我們用公認(rèn)的AhR 激動(dòng)劑胃黏膜保護(hù)藥物/胃腸潰瘍治療藥物奧美拉唑處理最常用和公認(rèn)的NSCLC 細(xì)胞模型A549（腺癌亞型NSCLC）和H460（大細(xì)胞肺癌亞型NSCLC），在此基礎(chǔ)上檢測了奧美拉唑?qū)hR 活性的影響以及對侖伐替尼殺傷NSCLC 細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫缺陷小鼠（BALB/c 品系的胸腺缺失小鼠，T 細(xì)胞缺失的免疫缺陷小鼠）購自北京市斯貝福生物科技有限公司；非小細(xì)胞肺癌A549、H460細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen 公司產(chǎn)品）的DMEM 培養(yǎng)液（Invitrogen公司產(chǎn)品）培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿等均購自康寧公司；侖伐替尼與奧美拉唑藥物純品購自Selleck 公司；AhR 的小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體購自Santa Cruz 公司；螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品；定量PCR 相關(guān)RNA提取與檢測試劑盒購自Applied Biosystems 公司；有機(jī)溶劑二甲亞砜（DMSO）購自國藥集團(tuán)；恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺等實(shí)驗(yàn)設(shè)備均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞抑制率檢測

培養(yǎng)A549 和H460 細(xì)胞，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（約8000/孔）。用DMSO 溶解奧美拉唑或侖伐替尼，再用含0.5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液將DMSO 溶液稀釋并配置系列濃度梯度的藥液（奧美拉唑的系列濃度梯度為10、3、1、0.3、0.1、0.03 及0.01 μmol/L，侖伐替尼的系列濃度梯度為1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003 及0.001 μmol/L）。以上述系列濃度梯度的藥物孵育A549 或H460 細(xì) 胞48 h 后進(jìn)行MTT 檢測，讀取D490nm值，計(jì)算 抑 制率：（對照 組D490nm值-實(shí) 驗(yàn)組D490nm值）/（對照組D490nm值）×100%[9]。利用抑制率計(jì)算藥物作用于細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.3 螢光素酶報(bào)告基因活性

化學(xué)合成5 聚體AhR 結(jié)合元件序列（GCGTG）5，將合成序列克隆到pGL4.26 載體上，所得AhR 結(jié)合元件螢光素酶報(bào)告基因載體命名為ARE-Luc。培養(yǎng)A549 或H460 細(xì)胞，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（約10 000/孔）。用DMSO 溶解奧美拉唑，再用含0.5% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液將藥物DMSO 溶液稀釋并配置為系列濃度梯度的藥液（奧美拉唑的系列濃度梯度為10、3、1、0.3、0.1、0.03 及0.01 μmol/L）。以上述系列濃度梯度的藥物孵育A549 或H460 細(xì)胞24 h后進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因檢測，按照廠商說明書檢測ARE-Luc 的活性。

1.4 定量PCR（qPCR）

培養(yǎng)獲得A549、H460 細(xì)胞，用DMSO 溶解奧美拉唑，再用含0.5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液將藥物DMSO 溶液稀釋并配置為系列濃度梯度的藥液（奧美拉唑的系列濃度梯度為10、3、1、0.3、0.1、0.03 及0.01 μmol/L）。以上述系列濃度梯度的藥物孵育A549 或H460 細(xì)胞24 h 后提取細(xì)胞總RNA 進(jìn)行定量PCR，檢測AhR 下游基因CYP1A1及CYP1A2 的表達(dá)水平。CYP1A1 正向引物為5′-GATTGAGCACTGTCAGGAGAAGC-3′，反向引物為5′-ATGAGGCTCCAGGAGATAGCAG-3′ ；CYP1A2正向引物為5′-TCATCCTGGAGACCTTCCGACA-3′ ，反 向 引 物 為5′-GCCACTGGTTTACGAAGA?CAC AG-3′；內(nèi)參β-actin 正向引物為5′-CAC?CATTGG CAATGAGCGGTTC-3′，反向引物為5′-AGGTCTT TGCGGATGTCCACGT-3′。

1.5 NSCLC細(xì)胞裸鼠皮下成瘤檢測

培養(yǎng)獲得A549 或H460 細(xì)胞，接種裸鼠皮下，3～4 d 后，動(dòng)物灌胃給予溶劑對照、1 mg/kg 侖伐替尼或1 mg/kg 侖伐替尼+2 mg/kg 奧美拉唑。動(dòng)物隔日給藥，治療10～15 次（3～4 周）后收集動(dòng)物獲得腫瘤組織，稱量腫瘤重量。測量腫瘤組織的長度與寬度后，計(jì)算腫瘤體積：腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2。依據(jù)腫瘤大小與腫瘤重量計(jì)算抑制率：（對照組腫瘤大小-治療組腫瘤大?。?對照組腫瘤大?。唬▽φ战M腫瘤重量-治療組腫瘤重量）/對照組腫瘤重量[10-11]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果表示為x±s，用SPSS 17.0 軟件，采用單因素方差分析計(jì)算P值，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用Origin 6.1 分析繪圖軟件計(jì)算藥物作用于細(xì)胞的IC50值。

表1 奧美拉唑誘導(dǎo)AhR活性的半數(shù)作用濃度

圖1 奧美拉唑能夠在NSCLC 細(xì)胞中誘導(dǎo)AhR 的轉(zhuǎn)錄因子活性

2 結(jié)果

2.1 奧美拉唑能夠劑量依賴地誘導(dǎo)AhR的轉(zhuǎn)錄因子活性

結(jié)果如圖1，在A549 及H460 細(xì)胞中，奧美拉唑能夠劑量依賴地誘導(dǎo)AhR 結(jié)合原件報(bào)告基因（ARE-Luc）的活性。在此基礎(chǔ)上，圖2 的結(jié)果顯示，奧美拉唑能夠在A549 及H460 細(xì)胞中劑量依賴地誘導(dǎo)AhR 下游基因CYP1A1 及CYP1A2 的mRNA 表達(dá)水平。表1 顯示奧美拉唑作用于AhR的半數(shù)作用濃度（EC50值）。結(jié)果表明，奧美拉唑能夠在NSCLC 細(xì)胞中誘導(dǎo)AhR 的轉(zhuǎn)錄因子活性。

2.2 奧美拉唑能夠下調(diào)分子靶向藥物侖伐替尼對NSCLC細(xì)胞的殺傷作用

奧美拉唑自身不具有對NSCLC 細(xì)胞A549（圖3A）或H460（圖3B）的殺傷作用。為此，選取2.1中奧美拉唑誘導(dǎo)AhR 活性的最大作用濃度（3 μmol/L）進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3 所示，奧美拉唑處理NSCLC 細(xì)胞A549 或H460，能夠顯著下調(diào)分子靶向藥物侖伐替尼對A549（圖3C）或H460細(xì)胞（圖3D）的殺傷作用。表2 顯示了不同組（對照組與奧美拉唑處理組）侖伐替尼殺傷NSCLC 細(xì)胞的IC50值與耐藥倍數(shù)（resistance folds）。同時(shí)，轉(zhuǎn)染AhR 的siRNA 能夠抑制奧美拉唑誘導(dǎo)的侖伐替尼耐受（表2）。這表明奧美拉唑能夠下調(diào)分子靶向藥物侖伐替尼對NSCLC 細(xì)胞的殺傷作用，奧美拉唑的作用是依賴于AhR 的。

圖2 奧美拉唑能夠劑量依賴地在NSCLC 細(xì)胞中誘導(dǎo)AhR 的下游基因CYP1A1 及CYP1A2 的mRNA 表達(dá)水平

圖3 奧美拉唑能夠下調(diào)侖伐替尼對NSCLC 細(xì)胞的殺傷作用

2.3 奧美拉唑能夠下調(diào)分子靶向藥物侖伐替尼對NSCLC細(xì)胞裸鼠成瘤的抑制作用

結(jié)果如圖4 所示，侖伐替尼能夠顯著抑制NSCLC 細(xì)胞A549 的皮下成瘤能力，口服灌胃給予奧美拉唑能夠下調(diào)侖伐替尼對A549 細(xì)胞皮下成瘤的抑制作用。在H460 細(xì)胞中也有類似結(jié)果（圖5）。這表明奧美拉唑能夠下調(diào)分子靶向藥物侖伐替尼對NSCLC 細(xì)胞裸鼠成瘤的抑制作用。

表2 侖伐替尼對NSCLC細(xì)胞殺傷作用的半數(shù)抑制率

圖4 奧美拉唑能夠下調(diào)侖伐替尼對NSCLC 細(xì)胞A549 皮下成瘤的殺傷作用

3 討論

NSCLC 是最主要的肺部腫瘤病理類型，此外還有一些其他的病理類型，包括小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）及少見病理類型（例如其他臟器腫瘤的肺轉(zhuǎn)移等）[12]。分子靶向治療現(xiàn)已成為進(jìn)展期NSCLC 抗腫瘤藥物治療的主要策略，有助于延長NSCLC 患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。但另一方面，過去的研究與臨床診療主要以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點(diǎn)，相關(guān)新藥研究的潛力越來越有限，同時(shí)EGFR抑制劑在臨床診療中也存在藥物耐受現(xiàn)象。以VEGFR 等為作用靶標(biāo)的新型分子靶向藥物開創(chuàng)了NSCLC 治療的新時(shí)代，但治療費(fèi)用昂貴。研究與開發(fā)分子靶向藥物增敏的治療策略，通過與其他藥物聯(lián)合使用以實(shí)現(xiàn)增加藥物作用效果、降低藥物用量或減緩藥物毒副作用等具有重要意義。

目前，NSCLC 等惡性腫瘤分子靶向治療主要是口服EGFR、VEGFR 等靶標(biāo)的抑制劑，EGFR、VEGFR 等不僅是抗腫瘤治療的理想干預(yù)靶標(biāo)，同時(shí)也是維持消化道內(nèi)皮細(xì)胞存活與消化道黏膜穩(wěn)定、再生的重要調(diào)控樞紐，分子靶向藥物在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)也會損傷胃腸黏膜，加重各種潰瘍性疾病。奧美拉唑是一種適用于胃潰瘍、十二指腸潰瘍、應(yīng)激性腸道潰瘍等腸道出血性疾病的常用藥物，被認(rèn)為有助于改善分子靶向藥物引起的多種腸道不適與損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，奧美拉唑能夠在NSCLC 細(xì)胞中誘導(dǎo)AhR 的轉(zhuǎn)錄因子活性，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞對新型分子靶向藥物侖伐替尼的耐受作用。AhR 在NSCLC 組織中高表達(dá)，能夠在NSCLC 增殖調(diào)控中發(fā)揮作用。AhR 的下游基因主要是各種藥物代謝酶類，上調(diào)AhR 的活性能夠通過上調(diào)下游基因的表達(dá)加速抗腫瘤藥物代謝，造成抗腫瘤藥物耐受。奧美拉唑能夠上調(diào)AhR 的活性，被認(rèn)為是AhR 較為典型的激動(dòng)劑。本研究不僅報(bào)道了新型分子靶向藥物侖伐替尼對NSCLC 細(xì)胞的殺傷作用，也揭示了奧美拉唑與侖伐替尼的潛在藥物相互作用，可為相關(guān)研究提供參考。

圖5 奧美拉唑能夠下調(diào)侖伐替尼對NSCLC 細(xì)胞H460 皮下成瘤的殺傷作用