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        利用報(bào)告基因的人7型腺病毒中和抗體檢測方法的建立

        2018-04-10 08:39:26李建華王步森吳詩坡王玉東趙拯浩侯利華
        生物技術(shù)通訊 2018年6期
        關(guān)鍵詞:螢光報(bào)告基因腺病毒

        李建華,王步森,吳詩坡,王玉東,趙拯浩,侯利華

        軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所,北京100071

        人腺病毒(human adenovirus,HAdV)屬于腺病毒屬,是一種無包膜的雙鏈DNA 病毒。已報(bào)道的HAdV 有90 種,根據(jù)血清學(xué)及分子學(xué)特性,分為A~G 共7 個(gè)亞群[1-2]。腺病毒感染可引起多種臨床綜合征,包括呼吸道疾病、結(jié)膜炎、膀胱炎、腸胃炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等,某些情況下甚至能夠?qū)е滤劳鯷3]。據(jù)報(bào)道,HAdV 是世界范圍內(nèi)急性呼吸道疾病的主要原因之一,5%~10%的兒童下呼吸道感染是由其導(dǎo)致的[4]。B 亞群的3、7、14、21、55型和C 亞群的1、2、5、6 型HAdV 是全球范圍內(nèi)引起急性呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原體[5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,7 型HAdV(HAdV7)占所有HAdV 感染的近20%,并且引起的疾病也最為嚴(yán)重,特別是對于小于7 歲的兒童和免疫缺陷人群[4,6-7]。

        HAdV7 也是造成我國腺病毒感染的主要血清型,近年來在我國北京、湖北、廣州、陜西、湖南等地和軍營都有較大規(guī)模的HAdV7 疫情暴發(fā),造成了嚴(yán)重?fù)p失[8-13]?,F(xiàn)階段沒有治療HAdV7 感染的有效藥物,美國國防部和梯瓦制藥聯(lián)合研發(fā)的4 型和7 型口服腺病毒活疫苗在預(yù)防腺病毒疫情暴發(fā)方面顯示出很好的效果[14]。迄今,我國沒有相關(guān)疫苗上市。目前檢測血清中腺病毒中和抗體的方法有兩類:一種是細(xì)胞病變法,腺病毒與抗體孵育后,觀察感染細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)或者檢測細(xì)胞的活性;另一種則是報(bào)告基因法,血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報(bào)告基因的表達(dá)水平,通過檢測報(bào)告基因表達(dá)被抑制程度來確定中和抗體水平,常用的報(bào)告基因有LacZ、GFP 和螢光素酶基因。傳統(tǒng)的CPE法周期長(4~8 d),觀察比較主觀,靈敏性低,不適于快速準(zhǔn)確檢測[15];而報(bào)告基因法可將檢測時(shí)間縮短至30 h,方法的重復(fù)性好[16]。本實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了表達(dá)螢光素酶的復(fù)制缺陷型Ad7-Luc重組病毒,建立了基于該重組病毒的HAdV7 中和抗體檢測方法,檢測了北京地區(qū)60 例血清中和抗體水平,初步了解HAdV7 的預(yù)存免疫水平。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        收集2017年3月于解放軍總醫(yī)院體檢人群的血清樣本,血清分裝后于-20℃凍存,共60份,其中男性和女性各30份。另外,選取經(jīng)CPE法驗(yàn)證的36份HAdV7陽性血清樣本用于報(bào)告基因法的建立和驗(yàn)證。

        HEK-293 細(xì)胞、A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,兩者分別用含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素的DMEM和1640培養(yǎng)液,于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);HAdV7-GZ08(GenBank No.GQ478341)毒株由本室保存;大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物有限公司;大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞由本室自備;胎牛血清、DMEM和1640培養(yǎng)液、青/鏈霉素、Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit、Tubfect轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒大提試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Gibson Assembly Cloning Kit,限制性內(nèi)切酶FspⅠ、AsiSⅠ、EcoRⅠ-HF、AatⅡ、BsiW Ⅰ和T4DNA連接酶體系購自NEB公司;2×EXTaqMix、Pyrobest PCR體系、DNA marker、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA片段回收試劑盒均購自TaKaRa公司;螢火蟲螢光素酶分析試劑和細(xì)胞裂解試劑購自Pro?mega公司;XenoLight D-Luciferin Potassium salt購自Perkin Eimer公司;引物合成和測序交由上海生物工程有限公司完成。

        1.2 Ad7-Luc重組病毒的制備

        首先用Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit 從腺病毒培養(yǎng)液中提取HAdV7-GZ08 的基因組,以其為模板擴(kuò)增帶有HAdV7 基因組的左右同源臂片段;以pAd4-dE3-luc 質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室前期制備)為模板,利用重疊PCR 法構(gòu)建含卡那霉素抗性基因及pBR322 復(fù)制原點(diǎn)的載體區(qū);然后將上述片段用Gibson Assembly Cloning Kit 的方法體外重組,從而獲得同源重組質(zhì)粒pAd7-re;接下來用FspⅠ內(nèi)切酶線性化的pAd7-re 片段與HAdV7-GZ08 的基因組通過電轉(zhuǎn)化在BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組,從而獲得HAdV7 的空載質(zhì)粒pAd7-V0;后續(xù)用EcoRⅠ-HF 內(nèi)切酶對質(zhì)粒E3 區(qū)進(jìn)行部分缺失和再連接獲得pAd7-dE3 質(zhì)粒;最后用AatⅡ和BsiWⅠ內(nèi)切酶對E1A 區(qū)進(jìn)行缺失并插入帶有MCMV 啟動子的螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)框,最終獲得重組pAd7-Luc 質(zhì)粒。相關(guān)引物序列見表1。

        用AsiSⅠ內(nèi)切酶將pAd7-Luc 質(zhì)粒線性化,并用Tubfect 轉(zhuǎn)染試劑將其導(dǎo)入HEK-293 細(xì)胞,培養(yǎng)3~7 d 直至細(xì)胞完全病變,并通過連續(xù)傳代觀察其穩(wěn)定性,最終獲得成熟的病毒顆粒,采用蛋白免疫法檢測腺病毒滴度。

        表1 引物名稱與序列

        1.3 Ad7-Luc重組病毒的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

        為了驗(yàn)證Ad7-Luc 重組病毒是否構(gòu)建成功,首先提取相關(guān)重組質(zhì)粒和病毒基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并將擴(kuò)增產(chǎn)物測序;其次采用蛋白免疫法檢測獲得的病毒滴度,用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的病毒感染A549 細(xì)胞,檢測24 h 后螢光素酶的表達(dá)情況;最后,將經(jīng)過Source 30Q 純化的重組pAd7-Luc 病毒以1×107IFU/只的劑量通過肌肉注射途徑感染BALB/c 小鼠,24 h 后用小動物活體成像儀觀察螢光素酶的表達(dá)情況。

        1.4 報(bào)告基因法檢測抗HAdV7中和抗體的建立與驗(yàn)證

        針對HAdV7 中和抗體的檢測參照5 型腺病毒螢光素酶報(bào)告基因檢測方法[16]。將血清于56℃滅活處理1 h,并將其按照首孔1/4 稀釋、后續(xù)逐步1/3 稀釋,最終 得 到1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916 共7 個(gè)稀釋度的血清;將50 μL 稀釋后的血清轉(zhuǎn)移至新的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每個(gè)樣本設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置不加血清和病毒的陰性孔,以及加入50 μL 病毒的陽性孔;每孔加入50 μL 稀釋的Ad7-Luc 重組病毒液,病毒最終含量為2×104IFU/孔,混勻后37℃孵育1 h;將A549 細(xì)胞用含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋至2×105/mL,每孔加入100 μL,于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;最后將細(xì)胞裂解,用螢光素酶分析檢測試劑盒檢測其表達(dá)水平。

        中和抗體滴度以陽性對照的螢光素酶表達(dá)為參照,將在血清稀釋度中病毒螢光素酶表達(dá)抑制達(dá)到90%(IC90)時(shí)認(rèn)定為該血清的中和抗體值,用GraphPad Prism 軟件中的四參數(shù)非線性回歸進(jìn)行計(jì)算。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證報(bào)告基因法的可靠性,采用傳統(tǒng)的CPE 法進(jìn)行對比分析,觀察2 種方法的一致性。將滴度為2000 TCID50/mL 的野生型7 型腺病毒與不同稀釋度的陽性血清樣本相互作用1 h,用含2%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至2.5×105/mL,每孔加入100 μL,培養(yǎng)至陽性對照孔完全病變后,每孔加入20 μL MTS 溶液,37℃孵育2 h,讀取D490nm值;最后,將CPE 法獲得的中和抗體滴度與報(bào)告基因法進(jìn)行一致性分析。此外,還對不同血清含量的培養(yǎng)基濃度,以及批間、批內(nèi)檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行驗(yàn)證分析。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析比較不同條件下測量的中和抗體滴度,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 Ad7-Luc重組病毒的制備與驗(yàn)證

        已建立的檢測5 型腺病毒中和抗體的螢光素酶報(bào)告基因法廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查和相關(guān)5型腺病毒載體疫苗的評價(jià)工作[17-18]。基于此方法,本研究中我們通過同源重組,在HAdV7 基因組中缺失E1A 區(qū)并插入螢光素酶基因而獲得pAd7-Luc 質(zhì)粒,具體流程如圖1。所有片段在構(gòu)建過程中都進(jìn)行了測序分析(相關(guān)引物序列見表1),最終將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)過包裝獲得成熟的復(fù)制缺陷型Ad7-Luc 重組病毒顆粒,病毒滴度可達(dá)4.85×108IFU/mL。

        提取pAd7-V0 和pAd7-Luc 質(zhì)粒,以及HAdV7和Ad7-Luc 重組病毒基因組,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,測序結(jié)果證明螢光素酶片段的大小、序列及插入位點(diǎn)與預(yù)期一致(圖2A)。以不同MOI 的Ad7-Luc 重組病毒感染A549 細(xì)胞,檢測到的熒光值不同,MOI 越高則熒光值越高(圖2B);以MOI=1 感染,24 h 后其熒光值約為8×105。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ad7-Luc 重組病毒是否構(gòu)建成功,將純化的Ad7-Luc 重組病毒以1×107IFU/只的劑量通過肌肉注射途徑感染BLB/c 小鼠,24 h 后通過小動物活體成像儀觀察熒光表達(dá)情況,Ad7-Luc 重組病毒注射部位可以檢測到明顯的熒光,對照組未檢測到熒光,單位時(shí)間和體積內(nèi)熒光表達(dá)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有顯著性差異(Mann-Whitney 檢驗(yàn),P=0.0079)(圖2C)。

        2.2 基于Ad7-Luc重組病毒中和抗體檢測方法的建立與驗(yàn)證

        檢測不同數(shù)量的A549 細(xì)胞感染不同稀釋度病毒24 h 后的熒光值,結(jié)果如圖3A,MOI 為0.0625~1 時(shí),熒光值與MOI 具有較好的線性關(guān)系;MOI<0.016 時(shí),平行孔間熒光值偏差較大。選擇MOI 為0.016~1 進(jìn)行后續(xù)中和抗體檢測方法學(xué)研究。以MOI=0.25、0.50、0.75 和1.00 的病毒劑量,檢測10 份HAdV7 陽性血清的中和抗體值,結(jié)果如圖3B,中和抗體檢測結(jié)果穩(wěn)定,4 組間抗體值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(One-Way ANOVA 檢驗(yàn),n=10,P>0.05)。參考HAdV5 中和抗體檢測病毒滴度,實(shí)驗(yàn)最終選擇MOI=0.75 用于中和抗體檢測。采用傳統(tǒng)CPE 法檢測中和抗體滴度,2 種方法的統(tǒng)計(jì)分析顯示了很好的一致性(R=0.8612,P<0.0001)(圖3C)。此外,為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性,我們還對細(xì)胞培養(yǎng)基血清含量的影響進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)組間沒有明顯差異(圖3D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證報(bào)告基因法檢測HAdv7 中和抗體的穩(wěn)定性,我們選擇陽性血清樣本對批間和批內(nèi)差異進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該方法可將批間差異控制在20%以內(nèi),批間差異控制在10%以內(nèi)(圖3E、F),說明方法穩(wěn)定,重復(fù)性好。

        2.3 北京地區(qū)人群7型腺病毒中和抗體陽性率

        基于建立的報(bào)告基因檢測方法,我們于2017年3月收集了北京地區(qū)共計(jì)60 份血清樣本,男女各占50%,分別進(jìn)行了針對7 型腺病毒和5 型腺病毒中和抗體水平的檢測,將中和抗體滴度按照<12、12~200、201~1000 和>1000 依次定義為陰性、低滴度、中滴度和高滴度。結(jié)果顯示北京地區(qū)針對7 型腺病毒的血清陽性率為60%(36/60),明顯低于對應(yīng)針對5 型腺病毒的血清陽性率75%(45/60),并且該人群7 型腺病毒的中和抗體水平多集中在12~200(低滴度)范圍內(nèi),占總?cè)巳旱?5%(圖4A、B)。圖4C 所示該人群中7 型腺病毒中和抗體滴度明顯低于Ad5(Mann-Whitney 檢驗(yàn),P=0.0026);此外進(jìn)一步對人群中男女性別間中和抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示7 型腺病毒的中和抗體水平并不存在性別間的差異(Mann-Whit?ney 檢驗(yàn),P=0.5828)(圖4D)。

        圖1 Ad7-Luc 重組病毒構(gòu)建包裝流程圖

        圖2 Ad7-Luc 重組病毒的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

        3 討論

        自1953年HAdV 首次被發(fā)現(xiàn)分離以來,陸續(xù)鑒定和分離的HAdV 已有79 種。4 型和7 型腺病毒引起的急性呼吸系統(tǒng)疾病一直是美軍幾十年來重點(diǎn)監(jiān)測的類型,近年來在美國、中國、意大利、印度、韓國等國家腺病毒引起的呼吸系統(tǒng)疾病檢出率和病例呈上漲趨勢[2-3,14]。HAdV7 作為造成我國腺病毒感染的主要血清型,近年來在我國多地和軍營都有較大規(guī)模的暴發(fā)[8-13]。

        國內(nèi)針對7 型腺病毒中和抗體的流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)報(bào)道最早可追溯到20 世紀(jì)90年代,趙錦銘等于1995年調(diào)查北京、南京、成都和??诘娜巳合俨《局泻涂贵w情況,結(jié)果顯示HAdV7 總的血清陽性率約22.2%,北京最高(33.5%),??谧畹停?.1%);1999年成都地區(qū)人群腺病毒中和抗體調(diào)查結(jié)果顯示HAdV7 血清陽性率約為15.4%[19-20]。然而自2000年以來,國內(nèi)并未有新的有關(guān)7 型腺病毒中和抗體的調(diào)查報(bào)告,一個(gè)重要的原因就是檢測方法的限制。傳統(tǒng)檢測方法主要依據(jù)其引起的細(xì)胞病變?nèi)ヅ袛啵哂兄饔^性,同時(shí)還存在周期長(4~8 d)、穩(wěn)定性差、靈敏度低等不足之處。而報(bào)告基因法中,螢光素酶活性檢測比LacZ和GFP 等報(bào)告基因檢測更敏感,操作方法也更為簡便快捷,并且所需靶細(xì)胞更少,使其適于大規(guī)模樣品的流行病學(xué)調(diào)查研究[15-16,21]。

        我們基于5 型腺病毒中和抗體螢光素酶報(bào)告基因法,通過同源重組方法構(gòu)建復(fù)制缺陷型表達(dá)螢光素酶報(bào)告基因的Ad7-Luc 重組病毒,并對病毒量、細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)基血清濃度等因素逐一驗(yàn)證,獲得了最佳的中和抗體檢測方法。在實(shí)驗(yàn)過程中將該方法與傳統(tǒng)的CPE 檢測方法進(jìn)行比較,二者顯示了良好的一致性,并且該報(bào)告基因檢測方法批間批內(nèi)實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。此方法的建立將檢測周期縮短至1 d,更加適用于大規(guī)模血清樣本的HAdV7 快速檢測,對了解和研究我國HAdV7 的血清流行病學(xué)提供了非常重要的方法。

        基于該螢光素酶報(bào)告基因法,我們收集并完成了北京地區(qū)60 份血清樣本的HAdV7 和HAdV5中和抗體檢測,發(fā)現(xiàn)HAdV7 血清陽性率為60%,中和抗體滴度多集中在12~200(低滴度)水平。對比1995年和1999年相關(guān)報(bào)道,我們發(fā)現(xiàn)近20年來北京地區(qū)7 型腺病毒血清陽性率由33.5%上升到60%,呈大幅度增長趨勢,由此可見7 型腺病毒引起的感染逐漸增加,須引起足夠的重視[22]。此外,本研究中60 份血清樣本針對HAdV5 中和抗體陽性率為75%,抗體滴度大于200 的樣本數(shù)占總體的45%,與前期報(bào)道(中和抗體陽性率72%,抗體滴度大于200 的樣本數(shù)占總體的46.4%)一致[17]。

        圖3 Ad7-Luc 重組病毒中和抗體檢測方法的建立和驗(yàn)證

        圖4 北京地區(qū)人群7 型腺病毒中和抗體陽性率

        研究發(fā)現(xiàn)HAdV7 血清陽性率明顯低于C 亞群的HAdV5(72%),顯著高于同亞群的HAdV14(24.8%)和HAdV55(22.4%),其 中HAdV14 和HAdV55 中和抗體滴度分別集中在201~1000(中滴度)和1>1000(高滴度)水平[3],這一研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)HAdV7 是B 亞群中更加易感的潛在血清型,其流行病學(xué)調(diào)查研究具有非常重要的意義。同時(shí),不同性別間中和抗體水平分析表明在不同性別間HAdV7 的感染沒有明顯差異,該結(jié)論與HAdV14 和HAdV55 相一致。此外,不同年齡段人群中HAdV7 中和抗體預(yù)存免疫水平仍須擴(kuò)大樣本含量做進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。

        HAdV7 作為一種潛在的易感腺病毒血清型,其引起的危害須得到進(jìn)一步關(guān)注和重視,基于螢光素酶報(bào)告基因中和抗體檢測方法的建立,對于了解和掌握我國HAdV7 預(yù)存免疫水平以及相關(guān)腺病毒疫苗的研發(fā)評價(jià)等工作具有重要意義。

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