劉艷菊，許永斌，王路路，陳金利，蘇曉燕，黃麗菲，桂瑞英，張賀航

大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連116600

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭陰性短桿菌，是一種普遍存在于淡水、污水及土壤中的條件致病菌[1]。嗜水氣單胞菌可分泌多種毒力因子（包括外毒素、胞外蛋白酶、結(jié)構(gòu)蛋白和信號(hào)相關(guān)蛋白），可引發(fā)動(dòng)物的敗血癥、局部皮膚潰爛和內(nèi)臟器官出血等癥狀，同時(shí)也可使人類患有急性腸胃炎、膽膜炎和肺炎等疾病[2-3]。目前市售多種抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌有抑制或殺滅作用，但由于長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致嗜水氣單胞菌的耐藥性增強(qiáng)，因此，發(fā)現(xiàn)新的抗菌靶點(diǎn)，開發(fā)新的抗菌藥物迫在眉睫[4]。

十一碳焦磷酸合成酶XreF 是嗜水氣單胞菌中一個(gè)保守的屬于順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族的胞內(nèi)酶，具有反式結(jié)構(gòu)，催化法尼基焦磷酸的鏈延長(zhǎng)，縮合得到十一碳烯基焦磷酸鹽[5-7]。在嗜水氣單胞菌等細(xì)菌的多種細(xì)胞壁多糖組分生物合成中，十一碳烯基焦磷酸鹽是糖基轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)載體[8-10]。脂多糖是嗜水氣單胞菌中內(nèi)毒素的主要成分，毒性作用主要有熱原性、白細(xì)胞數(shù)目減少或增多、彌漫性血管內(nèi)凝血、神經(jīng)癥狀及休克以至死亡等。此外，其中的抗原脂多糖還具有黏附因子的作用，而且一些脂多糖和主要外膜蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物與細(xì)胞黏附性和血凝性有關(guān)[11-13]。由于該酶在微生物中高度保守，且在細(xì)胞壁的早期合成中具有不可或缺的作用，因此十一碳焦磷酸合成酶失活途徑可作為新型抗菌藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)[14-15]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，十一碳焦磷酸合成酶是功能性同源二聚體，由2 個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量同為29×103的單體組成。目前對(duì)嗜水氣單胞菌內(nèi)十一碳焦磷酸合成酶的研究甚少，其具體結(jié)構(gòu)與功能機(jī)理不明[16-17]。本實(shí)驗(yàn)旨在原核表達(dá)并分離純化嗜水氣單胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF，為進(jìn)一步研究該酶的結(jié)構(gòu)和功能機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌由本實(shí)驗(yàn)室保藏；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金公司；Taq酶、T4DNA 連接 酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ購自大連寶生物工程有限公司；pPROEXHTa 載體購自Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 擴(kuò)增目的基因XreF

根據(jù)已知的XreF基因堿基序列（GenBank：PKD24907.1），用Primer 2.0 軟件設(shè)計(jì)上游引物（GGGCCATGGATATGTCGCTTTTGGCAG，下 劃 線處為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）和下游引物（GGGCTCGAGTTAGCCGGTCTGTTGCTC，下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以嗜水氣單胞菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min）。50 μL 擴(kuò)增體系包括嗜水氣單胞菌基因組DNA 模板1 μg/mL，上、下游引物各0.8 μmol/L，脫氧核苷酸混合物200 μmol/L，耐熱性DNA 聚合酶0.5 U，1× Ex Taq 擴(kuò)增緩沖液，加34 μL 超純水補(bǔ)足。4℃保存PCR 產(chǎn)物，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.3 重組表達(dá)載體pPROEX-HTa-XreF的建立和陽性克隆鑒定

取XreF基因PCR 回收產(chǎn)物和pPROEX-HTa載體各10 μL，分別用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，37℃反應(yīng)3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收含目的基因及載體的凝膠條帶，向反應(yīng)體系中加入T4DNA 連接酶1 μL，于16℃反應(yīng)過夜，將目的片段與載體連接。用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液涂布于含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，次日從平板上挑取單菌落于3 mL LB 培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取陽性質(zhì)粒測(cè)序。

1.4 XreF的原核表達(dá)和純化

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒pPROEX-HTa-XreF轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，形成穩(wěn)定的高表達(dá)菌株，挑取菌落劃線培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜；通過液體LB 培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)，使菌液D600nm值達(dá)到0.6～1.2，加入終濃度為0.5 mmol/L 的誘導(dǎo)劑IPTG，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。

收集菌體，用緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）懸浮后超聲波破碎（超聲破碎5 min，間隔10 min，超聲5 次），13 000 r/min 離心30 min，棄沉淀；上清液首先經(jīng)金屬鎳離子螯合層析（Ni2+-NTA 柱）初步分離目的蛋白后，用 洗 滌 緩 沖 液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）洗4 次，再用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris- HCl，150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH8.0）洗脫目的蛋白至50 mL EP管中；采用BCA 法定量測(cè)定目的蛋白濃度，用15% SDS-PAGE 進(jìn)行純化鑒定，將初步純化的蛋白用TEV 蛋白酶切除組氨酸標(biāo)簽，用15% SDSPAGE 鑒定酶切結(jié)果。

用離子交換層析進(jìn)一步分離純化酶切成功的XreF 蛋白。先用緩沖液B（20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，2 mmol/L β巰基乙醇，pH8.0）清洗Q 柱，洗去殘留雜蛋白，再用緩沖液A（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β巰基乙醇，pH8.0）平衡柱子，然后將用4 倍體積的緩沖液A 稀釋的待純化的蛋白質(zhì)與離子交換柱結(jié)合，用緩沖液B、緩沖液A 的混合液對(duì)目的蛋白進(jìn)行線性洗脫，在280 nm 波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)洗脫結(jié)果并收集目標(biāo)樣品。根據(jù)洗脫峰譜圖選擇樣品，用15% SDS-PAGE 檢測(cè)分析，回收目的蛋白，濃縮至5 mL 備用。在AKTA 層析系統(tǒng)中用凝膠過濾柱（HiLoad 16/600，Superdex 200pg）進(jìn)一步純化蛋白，緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β巰基乙醇，150 mmol/L NaCl，pH8.0）流速0.5 mL/min，于280 nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)結(jié)果并收集目標(biāo)樣品。根據(jù)洗脫峰譜圖，選擇樣品用15% SDS-PAGE 檢測(cè)分析，回收目的蛋白，濃縮后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 XreF蛋白聚集狀態(tài)檢測(cè)

在500 μL 0.8 mg/mL 的XreF 蛋白溶液中加入終濃度為5 mmol/L 的MgCl2溶液，室溫孵育30 min 后注入Superdex75 凝膠過濾層析柱，用AKTA蛋白純化系統(tǒng)設(shè)置0.4 mL/min 流速，以凝膠緩沖液（Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，β巰基乙醇2 mol/L，pH8.0）進(jìn)行洗脫；對(duì)照組蛋白不加MgCl2處理，500 μL 0.1 mg/mL 的XreF 蛋白室溫靜置30 min 后注入Superdex75 凝膠過濾層析柱，以相同條件進(jìn)行洗脫。洗脫完成后，記錄洗脫峰峰值對(duì)應(yīng)的洗脫體積，依據(jù)凝膠過濾柱標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算洗脫峰蛋白相對(duì)分子質(zhì)量，通過與XreF 蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)比，確定蛋白聚集狀態(tài)，從而驗(yàn)證XreF 蛋白聚集狀態(tài)以及鎂離子對(duì)XreF 蛋白聚集狀態(tài)的影響。

圖1 XerF 基因片段擴(kuò)增電泳圖

圖2 pPROEX-Hta-XreF 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2 結(jié)果

2.1 XreF基因的擴(kuò)增

以嗜水氣單胞菌基因組DNA 為模板PCR 擴(kuò)增目的基因，大小與XreF目的基因片段大小為774 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出1 條特異性條帶，大小與XreF目的基因（774 bp）一致（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將提取質(zhì)粒后的重組表達(dá)載體pPROEXHTa-XreF 用NcoⅠ和XhoⅠ限制酶內(nèi)切酶特異性切割后進(jìn)行核酸電泳，選取3 個(gè)陽性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，泳道3 樣品顯示了XreF基因條帶和載體條帶（圖2），說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果與XreF基因序列完全一致。

2.3 鎳離子親合層析

將重組質(zhì)粒pPROEX-HTa-XreF 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG 濃度于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，菌體重懸液經(jīng)超聲波破碎后，取上清液進(jìn)行鎳離子親和層析。初步純化后的蛋白經(jīng)15% SDSPAGE 分析，考馬斯亮藍(lán)染色，3 號(hào)樣品出現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量約29×103的特異性條帶，與預(yù)期大小一致，說明目的蛋白XreF 獲得表達(dá)（圖3）。

圖3 XreF 蛋白鎳離子親和層析純化結(jié)果

圖4 XreF 蛋白離子交換層析結(jié)果

圖5 XreF 蛋白凝膠過濾層析純化結(jié)果

2.4 XreF蛋白的純化

2.4.1 離子交換層析純化 將切除組氨酸標(biāo)簽之后的目的蛋白進(jìn)行離子交換層析，在洗脫峰中取樣，進(jìn)行15% SDS-PAGE 檢測(cè)分析，結(jié)果見圖4。洗脫峰雖然出現(xiàn)了目的蛋白XreF 的條帶，但仍有部分雜蛋白。因此，收集第一個(gè)洗脫峰樣品后，還須通過凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，以提高XreF蛋白的濃度。

2.4.2 凝膠過濾純化 將離子交換層析純化的XreF 蛋白濃縮后進(jìn)行凝膠過濾層析，在洗脫峰上取樣后用15% SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果見圖5，獲得的蛋白純度較高。用超濾管將洗脫峰中的蛋白樣品進(jìn)行濃縮，經(jīng)檢測(cè)濃度為17.5 mg/mL。

2.5 XreF蛋白聚集檢測(cè)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鎂離子能提高XreF 蛋白酶的活性，加快其與底物的結(jié)合[18]。圖6 出峰位置為18.03 mL，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=10（-0.1306x+3.8213）計(jì)算，該洗脫峰對(duì)應(yīng)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約29.3×103，與理論值一致，因此洗脫峰對(duì)應(yīng)蛋白是XreF蛋白的單聚體。同時(shí)對(duì)照?qǐng)D7 可知，鎂離子對(duì)XreF 蛋白的聚集狀態(tài)有明顯影響，出峰位置為15.70 mL，對(duì)應(yīng)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為59×103，約為單倍體的2 倍。鎂離子是這種蛋白酶發(fā)揮催化活性的的重要配體，我們的研究結(jié)果表明，XreF蛋白很可能在鎂離子的誘導(dǎo)下，由非活性狀態(tài)（單體）向活性狀態(tài)（二聚體）轉(zhuǎn)化。

2.6 XreF結(jié)構(gòu)力分析

目前，已有包括大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌等在內(nèi)的多種微生物的XreF 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道，這些同源蛋白晶體結(jié)構(gòu)均為二聚體，與我們檢測(cè)到的嗜水氣單胞菌XreF 具有相同的聚集方式。與嗜水氣單胞菌XreF 序列相似度最高的為大腸桿菌XreF 蛋白，氨基酸序列相似度高達(dá)63.6%。大腸桿菌XreF 結(jié)構(gòu)（PDB code：5CQB）中，每個(gè)單體延伸出的2 個(gè)α螺旋之間的疏水相互作用是二聚體形成的主要作用力。因此，從蛋白同源性角度分析，嗜水氣單胞菌XreF 蛋白很可能以相同的作用力形成二聚體（圖8）。

圖6 未加Mg2+的XreF 蛋白聚集狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果

圖7 加入Mg2+的XreF 蛋白聚集狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來，嗜水氣單胞菌引發(fā)的疾病頻繁發(fā)生，給我國淡水漁業(yè)的發(fā)展帶來了很大挑戰(zhàn)，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，越來越受到公眾的關(guān)注[19]。據(jù)Gen?Bank，嗜水氣單胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF 由258 個(gè)氨基酸殘基組成，其編碼基因全長(zhǎng)774 bp。XreF 負(fù)責(zé)十一碳烯基焦磷酸鹽生物合成，是細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成中的必需酶。十一碳焦磷酸合成酶是一類存在于所有生命體中的酶，具有傳遞信息、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的功能[20]。近年來，有關(guān)嗜水氣單胞菌中十一碳焦磷酸合成酶的同源蛋白研究較多。Kuo 等解析出幽門螺桿菌中十一碳焦磷酸合成酶的晶體結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)了相關(guān)抑制劑[20]；Inooshi 等發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌毒素和螺環(huán)己烷對(duì)十一碳焦磷酸合成酶活性具有抑制作用，特別是在抗革蘭陽性菌中的耐甲氧西林金黃色葡萄球[7]。但針對(duì)嗜水氣單胞菌中十一碳焦磷酸合成酶的研究較少，仍是一個(gè)未充分開發(fā)的新型抗菌藥物的領(lǐng)域。我們本次實(shí)驗(yàn)的目的主要是表達(dá)純化嗜水氣單胞菌中的十一碳焦磷酸合成酶，獲得較高純度的目的蛋白，為后續(xù)嗜水氣單胞菌中的XreF蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)研究、晶體結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)，也為其相關(guān)新型抗菌藥物的研發(fā)提供材料。

圖8 大腸桿菌XreF 蛋白二聚體形成方式