張亞楠，常振宇，劉婕，丁麗華，葉棋濃

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100850；2.解放軍總醫(yī)院 肝膽外二科，北京100853

肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其死亡率和發(fā)病率都呈逐漸上升的趨勢(shì)，已經(jīng)成為僅次于胃癌和食道癌的第三大常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。我國(guó)肝癌新發(fā)案例占全球的59%，發(fā)病率是全球平均發(fā)病率的3 倍，確診之后5年生存率僅為10%。

四個(gè)半LIM 結(jié)構(gòu)域（four and a half LIM do?mains，F(xiàn)HL）蛋白1（FHL1）屬于FHL 家族，后者是LIM 超家族中只含有LIM 結(jié)構(gòu)域的蛋白家族[2]。LIM 是Lin-11、Isl-1 和Mec-3 這3 種同行域（home?odomain）蛋白質(zhì)的首字母縮寫(xiě)。LIM 結(jié)構(gòu)域是富含半胱氨酸的雙鋅指結(jié)構(gòu)[3]，通過(guò)介導(dǎo)某些結(jié)構(gòu)蛋白、激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等多種蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)某些基因的表達(dá)、細(xì)胞分化與發(fā)育、細(xì)胞骨架形成等發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clus?tered regularly interspaced short palindromic re?peat，CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白9 核酸酶（CRIS?PR-associated protein 9，Cas9）是以細(xì)菌與古生菌抵御外源病毒入侵獲得性免疫為基礎(chǔ)的基因編輯新技術(shù)[5]，經(jīng)過(guò)人工改造后可靈活地對(duì)真核細(xì)胞進(jìn)行特異的基因組編輯，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高和突變位點(diǎn)選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來(lái)分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)技術(shù)之一[6]。本研究采用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，在人肝癌細(xì)胞系HepG2 中進(jìn)行FHL1基因的敲除，通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移能力的檢測(cè)，評(píng)價(jià)CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在肝癌細(xì)胞水平的基因靶向編輯效果，為今后研究FHL1 蛋白在肝癌細(xì)胞中的功能提供基因敲除的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293T、人肝癌細(xì)胞HepG2、大腸桿菌DH5α和CRISPR/Cas9 載體（本實(shí)驗(yàn)室保存）；pPack Packaging Plasmid Mix 病毒包裝載體（SBI公司）；BsmBⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA 連接酶、T4多聚核苷酸激酶（NEB 公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Promega 公司）；膠回收試劑盒、細(xì)胞基因組提取試劑盒（康為世紀(jì)公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gib?co 公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；抗FHL1的兔多克隆抗體（Proteintech 公司）；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG、兔抗人GAPDH（Santa Cruz 公司）；小 向 導(dǎo)RNA（small guide RNA，sgRNA）序列合成、鑒定引物合成及質(zhì)粒測(cè)序由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

1.2 sgRNA的設(shè)計(jì)

根據(jù)CRISPR/Cas9 基因編輯靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，利用CRISPR 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/），在人FHL1基因的第三外顯子序列設(shè)計(jì)sgRNA。sgRNA 對(duì)應(yīng)的靶序列長(zhǎng)度應(yīng)為20 bp，靶序列的3′端緊跟NGG 序列，最后選擇網(wǎng)站評(píng)分最高的序列。根據(jù)設(shè)計(jì)的sgRNA 序列，在正義鏈模板的5′端添加CACC，反義鏈模板的5′端添加AAAC，使其均能與BsmBⅠ酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)。同時(shí)根據(jù)靶點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)了FHL1敲除效果鑒定引物。引物序列見(jiàn)表1。

1.3 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將LentiCRISPR 載體在37℃用BsmBⅠ酶切30 min，膠回收酶切后的載體。將合成的sgRNA引物12 000 r/m 離心后加入適量雙蒸水，使引物的終濃度為100 μmol/L，充分溶解后用T4多聚核苷酸激酶將sgRNA 引物退火成雙鏈（反應(yīng)體系：上、下游鏈各1 μL，10×T4DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液1 μL，雙蒸水6.5 μL，T4多聚核苷酸激酶0.5 μL；反應(yīng)條件：37℃ 30 min，95℃ 5 min，然后以5℃/min 的速度降至25℃）。用T4DNA 連接酶將退火后的雙鏈插入酶切后的LentiCRISPR 載體（反應(yīng)體系：酶切的LentiCRISPR 載體1 μL，退火形成的sgRNA 寡核苷酸雙鏈1 μL，10×T4DNA 連接酶緩沖液1 μL，T4DNA 連接酶緩沖液1 μL，雙蒸水6 μL；室溫連接30 min）。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB 平板篩選，挑取單克隆測(cè)序鑒定。

表1 合成寡核苷酸序列

1.4 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA慢病毒的包裝與感染

將293T 細(xì)胞接種于6 孔板，以轉(zhuǎn)染時(shí)密度為50%～70%為宜；24 h 后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將1 μg Lenti?CRISPR-FHL1-sgRNA 質(zhì) 粒 或LentiCRISPR 質(zhì) 粒 與0.84 μg PLP1、0.4 μg PLP2 及0.56 μg VSVG 加入200 μL 不含血清雙抗的DMEM 中，振蕩混勻，加入10 μL Megatran 1.0 轉(zhuǎn)染試劑，再次振蕩混勻；室溫靜置10 min，將上述混合物加到種有293T 細(xì)胞的6 孔板中，37℃溫箱培養(yǎng)，48 h 后收集上清；取300 μL 病毒上清滴加到準(zhǔn)備好的密度約為60%的HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基中，24 h 后換液，再次滴加300 μL 病毒上清進(jìn)行二次感染，培養(yǎng)24 h 后換成帶有嘌呤霉素的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；加藥1 周后，將帶有抗性的單克隆集落用槍頭吸取吹散于24 孔板中，長(zhǎng)滿(mǎn)后傳至小皿培養(yǎng)。

1.5 單克隆細(xì)胞基因組DNA的提取及鑒定

待小皿中的單克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，收取部分細(xì)胞，提取基因組DNA，將基因組DNA 作為模板，與設(shè)計(jì)的鑒定引物構(gòu)成體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，連接pBM23-T 載體，轉(zhuǎn)化涂板，挑取不同單克隆測(cè)序鑒定。

1.6 Western印跡檢測(cè)HepG2FHL1基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞株

收取部分對(duì)照和FHL1敲除的HepG2 細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰浴30 min，加入等體積的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮15 min，進(jìn)行SDS-PAGE；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，F(xiàn)HL1 抗體 和GAPDH 抗 體室 溫 孵 育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；再用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG 孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.7 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

將對(duì)照細(xì)胞株和FHL1敲除的HepG2 細(xì)胞分別消化和計(jì)數(shù)，接種至96 孔板中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞約3000 個(gè)。在設(shè)定好的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μL Cell Counting Kit 8 試劑，37℃靜置1 h，取出后測(cè)定樣品的D450nm值。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將對(duì)照細(xì)胞株和FHL1敲除的HepG2 細(xì)胞分別消化，接種至6 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，用無(wú)菌移液器槍頭在孔中劃出3 條橫線，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞2 次，去除殘留的細(xì)胞，然后加入含0.5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于0、24 h 拍照，觀察細(xì)胞距劃痕中心的距離。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用x±s表示。數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒用U6 引物測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示FHL1sgRNA 成功插入LentiCRISPR 載體，經(jīng)序列比對(duì)，圖1 虛線框內(nèi)的序列與設(shè)計(jì)的sgRNA序列完全一致，說(shuō)明LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Western印跡檢測(cè)HepG2FHL1基因敲除細(xì)胞株內(nèi)FHL1蛋白的表達(dá)

將LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 包裝的慢病毒感染HepG2 細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后進(jìn)行無(wú)限稀釋?zhuān)龁慰寺〖?xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)小皿后，挑取4 個(gè)細(xì)胞克隆，用Western 印跡檢測(cè)FHL1 的表達(dá)（圖2）。結(jié)果顯示，第2 個(gè)單克隆細(xì)胞中FHL1 蛋白完全沒(méi)有表達(dá)。分別提取對(duì)照細(xì)胞和第2 個(gè)單克隆細(xì)胞的基因組DNA，用設(shè)計(jì)的鑒定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞基因組DNA 相比，F(xiàn)HL1sgRNA 于第三外顯子產(chǎn)生了7 bp 缺失突變，可以改變FHL1基因的開(kāi)放讀框，從而終止FHL1 蛋白的翻譯（圖3）。結(jié)果說(shuō)明HepG2 細(xì)胞FHL1基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功，將其命名為HepG2-FHL1-KO 細(xì)胞。

圖1 LentiCRISPR-FHL1-sgRNA 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2.3 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2-FHL1-KO細(xì)胞增殖速度的變化

將HepG2-FHL1-KO 細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞接種于96 孔板，用Cell Counting Kit 8 試劑盒檢測(cè)敲除FHL1對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照細(xì)胞相比，敲除FHL1可以顯著促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖（圖4），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2-FHL1-KO細(xì)胞遷移能力的變化

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)比較對(duì)照細(xì)胞和FHL1敲除的HepG2 細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示，敲除FHL1可以明顯促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的遷移（圖5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

肝癌是一種難發(fā)現(xiàn)、難診斷、難治療、發(fā)展快和預(yù)后差的惡性腫瘤，5年生存率只有10%左右，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康和生命。手術(shù)治療、放射治療和藥物治療是目前肝癌治療中的3 種常規(guī)方法，但這些治療方式都存在一定的局限性：手術(shù)治療不適用于很多中晚期肝癌患者；放射治療對(duì)患者正常組織損傷大且容易復(fù)發(fā)；藥物治療的毒副作用明顯，較其他實(shí)體腫瘤更不敏感[7]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多通路共同參與的過(guò)程，近年來(lái)隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，我們可以很容易地從不同腫瘤細(xì)胞中獲取基因組信息，分析比較不同基因在腫瘤細(xì)胞中所發(fā)揮的不同作用，從而使得針對(duì)肝癌的基因治療成為可能。

圖2 Western 印跡檢測(cè)單克隆細(xì)胞中FHL1 蛋白的表達(dá)

圖3 對(duì)照細(xì)胞（A）和第2 個(gè)單克隆細(xì)胞（B）基因組DNA 測(cè)序結(jié)果

RNA 干擾（RNAi）技術(shù)，是由雙鏈RNA 介導(dǎo)，引起同源mRNA 高效特異性降解，抑制特異性基因的表達(dá)。作為一種高效的序列特異性基因沉默技術(shù)，RNAi 在探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8]。但RNAi技術(shù)也存在一定的局限性，如不徹底性、插入染色體位置不確定性和存在脫靶效應(yīng)等，會(huì)在一定程度上影響我們對(duì)基因功能的研究。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2-FHL1-KO 遷移速度的變化

CRISPR/Cas9 技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種基因編輯技術(shù)，以細(xì)菌和古生物菌體內(nèi)的免疫防御機(jī)制為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)改造，已經(jīng)成功地在人、小鼠、水稻和斑馬魚(yú)等生物上得到廣泛應(yīng)用[9]。相較于RNAi、鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、細(xì)胞毒性小和基因編輯效率高等特點(diǎn)，迅速成為基因治療領(lǐng)域的一種新手段[10]。

FHL1家族共有FHL1[11]、FHL2[12]、FHL3[13]、FHL4[14]、FHL5/ACT[15]等5 個(gè)成員，它們表達(dá)分布于不同組織中。FHL1 在該家族中表達(dá)最為廣泛，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL1 在腦、乳腺、肝、肺、腎、前列腺和皮膚等人組織腫瘤中的表達(dá)水平下降；FHL1 通過(guò)參與TGFβ信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)下游靶基因p21 和c-Myc 的表達(dá)，抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[16]；FHL1 通過(guò)與雌激素受體（ER）相互作用，抑制ER 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]；FHL1 和Smad4 可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制VEGF 的表達(dá)[18]。

本研究采用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了Lenti?CRISPR-FHL1-sgRNA 重組質(zhì)粒，包裝病毒感染HepG2 細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選得到陽(yáng)性細(xì)胞，Western 印跡檢測(cè)FHL1 蛋白的表達(dá)，提取細(xì)胞基因組DNA 進(jìn)一步測(cè)序鑒定，最終構(gòu)建了HepG2FHL1基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株，同時(shí)用生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。結(jié)果表明，F(xiàn)HL1基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株的增殖和遷移能力均有顯著提升，這與報(bào)道的FHL1在肝癌中的抑癌作用一致。綜上，HepG2 細(xì)胞FHL1基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株模型的建立，為進(jìn)一步研究FHL1基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。