田靖

南部戰(zhàn)區(qū) 疾病預防控制中心，云南 昆明650031

人類對蛇毒的認識起始于原始狩獵時期使用的毒箭，古希臘時期蛇毒還被制成“萬能解毒藥”用于解毒和戰(zhàn)傷止血。隨著科技的進步，蛇毒被越來越多地應用于醫(yī)藥領域。蛇毒組成具有高度的復雜性和多樣性，對蛇毒研究的歷史也是人類現代藥理學建立的歷史。隨著“蛇毒組學”等新技術的運用，科學家們對蛇毒的成分和作用機理也有了越來越多的了解，蛇毒演化的研究也一直是遺傳學家關注的焦點。

1 蛇毒組成和功能多樣性

目前發(fā)現的毒蛇種類約有500 多種[1]，均屬于新蛇類（即新蛇下目），分為蝰蛇科（Viperidae）、穴蝰科（Atractaspididae）、眼鏡蛇科（Elapidae）和游蛇科（Colubridae）共4 科。

蛇毒由具有高度特異性的蛇毒腺體分泌，由大量的蛋白質以及超過900 種多肽類物質和代謝產物共同組成[2]。蛇毒蛋白的相對分子質量為6000～10 000，可分為具有酶活性和不具有酶活性2 類，大多數蛋白和多肽都以單體形式存在，單獨發(fā)揮藥理學功能，而一部分蛋白則通過共價鍵或非共價鍵與其他蛋白形成復合物，表現出更強的藥理活性，大大增強毒素的致死能力[3]。電鏡觀察證實，毒素蛋白可以損傷血管壁的內皮細胞，使內皮細胞產生泡狀結構，細胞核周圍空間膨脹，從而破壞細胞膜。多肽類物質由2～15 個氨基酸殘基組成，在響尾蛇和蝰蛇中含量較多。蛇毒中的多肽可結合于獵物的多種受體位點[4]，選擇性作用于關鍵性酶、受體或離子通道，使其生物學功能改變，進而破壞中央和周圍神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肌肉神經系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的平衡[5]。蛇毒代謝產物包括嘌呤核苷酸及堿基、神經遞質、胍基復合物、羧酸類化合物、胺類、單糖/雙糖類以及氨基酸等，小分子代謝產物可能是蛇毒致死的主要原因，而含量最高的有機代謝物檸檬酸可以阻止蛇毒的降解。

蛇毒蛋白在每個獨立科別內同源性較高，屬于共同的蛋白家族，但一些特殊蛋白家族也在不同的蛇科普遍存在。這些毒素蛋白在氨基酸序列和豐度上存在差異，因此在不同蛇科內發(fā)揮不同的生物學功能。例如，蝰蛇科毒素中有大量酶活物質，影響凝血，具有輕微的神經毒素功能；眼鏡蛇科家族毒素具有高度的神經毒素活性；穴蝰科毒素具有各種多肽類毒性，影響心血管系統(tǒng)；游蛇蛇毒具有一些類似于蝰蛇和眼鏡蛇蛇毒的活性[6]。

2 蛇毒的合成與調控

2.1 蛇毒合成是環(huán)境適應性的昂貴代謝過程

蛇毒對于蛇類自身來說是一種珍貴的代謝產物，其合成過程高度消耗能量，Marshall 等對提取蛇毒后的美國蝮蛇進行了代謝率評估，發(fā)現在蛇毒消耗后自我補給的72 h 內整體代謝率提高了11%[7]。對于如此珍惜的資源，蛇類在長期進化的過程中也形成了以節(jié)約的方式使用蛇毒，如響尾蛇（Echisspp.）釋放蛇毒的量是依據獵物體態(tài)大小來決定的[8]。雖然過量的毒液可以快速殺死獵物，但獵物死亡速度在提高毒蛇適應性方面是不必須的，沒有成為蛇類演化的驅動力，因此大量毒液釋放可能造成浪費，而節(jié)約使用蛇毒的方式被保留下來。

毒蛇還可以針對特定獵物生成特異性毒素，如在紅樹林蛇（Boiga dendrophila）蛇毒中分離得到針對鳥類的特有的denmotoxin 毒素[9]。

2.2 蛇毒合成調控具有周期性

蛇毒合成是一個動態(tài)調控過程，毒素成分可以隨著生活環(huán)境[10]、飲食、生長季節(jié)和發(fā)育階段[11]而改變。毒腺是改構的腮旁腺，是毒素合成的主要部位，主要由致密折疊的分泌上皮（epithelium）和多種類型細胞組成，包括腺分泌細胞（glandu?lar secretory cell）、富含線粒體細胞（mitochondriarich cell）、橫向細胞（horizontal cell）和“黑暗”細胞（"dark" cells）等。毒蛇在釋放毒液后易變得比較脆弱，因而需要一個高效的毒素生產系統(tǒng)，幫助其快速恢復“武器”效能，而這些大量富集的分泌細胞在快速再合成毒素蛋白及其他組分、及時補充毒液儲備的過程中是必要的。

一個完整的毒素生產周期比哺乳動物唾液腺或胰腺蛋白的生產周期要長，分泌細胞通常經歷由“靜止期”進入“活躍期”，再進入“靜止期”的循環(huán)過程。新毒素的合成伴隨著毒素釋放而啟動，當接受到毒素合成的刺激信號后，毒素分泌細胞開始發(fā)生一系列形態(tài)學和生物化學方面的改變。研究發(fā)現，在蛇毒排出至以后的8 d 時間里，可見分泌上皮細胞增大、形態(tài)發(fā)生柱狀性改變，粗糙內質網、高爾基體、亞細胞結構、分泌小體以及線粒體的細胞膜增加。蛇毒排出后4～8 d，分泌細胞合成活性最強，細胞內mRNA 濃度最高，毒素蛋白的合成逐步增加并趨于穩(wěn)定，8 d 時達到峰值；隨后，細胞合成活性降低，毒素逐漸在內腔中儲存下來，毒腺重新回到“靜止期”，直到下一次毒素合成激活。

2.3 蛇毒合成的不同步性

Currier 等的研究顯示，蛇毒合成在某些方面是穩(wěn)定遺傳的，可能存在高度調控機制以確保蛇毒可以快速合成[12]。毒素生產周期中關鍵性毒素是在毒素合成起始階段同步合成的。通過分析靜止期、蛇毒抽取后0～1、0～3、0～7 d 主要毒素成分及蛇毒中的mRNA 發(fā)現，關鍵毒素mRNA 的表達在毒液釋放后立刻處于全面活躍狀態(tài)，并在3～7 d 達到轉錄高峰。利用反向HPLC-Mass 檢測關鍵毒素蛋白的表達，主要毒素成分在毒素釋放后迅速表達，含量和相對組成在毒素合成周期內較為穩(wěn)定，并且初期合成毒素的活性與成熟毒素活性沒有顯著性差異。

有研究則認為，不同毒素在不同時間表達譜具有差異[13]，并非所有蛋白均在激活期合成[14]，說明不同毒素具有非同步合成的特點。毒腺處于“靜止期”或“激活期”時，毒素蛋白的種類是不完全相同的。毒腺的“靜止期”也已發(fā)現了絕大多數毒素蛋白種類，如富含半胱氨酸分泌蛋白（cys?teine-rich secretory protein，CRISP）、蛇毒金屬蛋白酶（snake venom metalloproteinase，SVMP）、磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase，LAAO）和解聚素（disinteg?rin）等。不僅如此，“靜止期”還表達一些特異的蛋白，如C 型凝集素蛋白（C-type lectin proteins，CTL）和蛇毒絲氨酸蛋白酶（snake venom serine proteinase，SVSP）等在“靜止期”的含量較“激活期”更為豐富，GPⅠb-BP 和促凝因子Ⅸ/Ⅹ蛋白則只在“靜止期”出現，在蛇毒提取后1 d 這些蛋白就不再被檢出。“靜止期”的絕大多數毒素蛋白進入“激活期”后，表達更為活躍，蛋白種類也更為豐富。

毒腺中的非毒素蛋白可能與毒素蛋白的合成速度調控模式相關。在毒腺“靜止期”，細胞質蛋白和內質網蛋白的合成種類增加，可能與毒素的合成和分泌過程相關。在毒腺“激活期”，與毒素分泌細胞合成和釋放功能相關的蛋白質合成增加：如肌動蛋白等細胞骨架蛋白增多，與淀粉酶分泌相關；內質網相關蛋白二硫鍵異構酶表達增高，與內質網新合成蛋白的二硫鍵修飾和蛋白質的正確折疊有關；核糖體合成增加與蛋白合成、與mRNA 和tRNA 的轉錄起始相關；硫氧還蛋白的合成可能在特異蛋白的轉錄、翻譯、翻譯后修飾及蛋白相互作用等方面具有重要功能等。這些非毒素相關蛋白在“激活期”合成，保證了新蛋白和新毒素的合成、正確折疊、對細胞骨架的識別、正確的結構以及轉錄后的修飾等，在毒素合成和調控系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用。

2.4 毒素合成的轉錄后修飾

蛇毒中的mRNA 可以在蛇毒中異常穩(wěn)定地存在，即使在含核酸酶及磷酸二脂酶的環(huán)境中也不被降解[15]，內質網分泌的微孔狀小體（microvesicu?lar bodies）可能對RNA 具有保護作用。毒素的合成是蛇類毒腺的復雜代謝過程，比較合理的推測是，毒素相關基因的轉錄很可能在毒腺“靜止期”就存在了，但調控卻進一步發(fā)生在毒素生產周期的后續(xù)階段。蛇毒中大范圍識別到金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，表明蛋白酶處理以及轉錄后修飾的發(fā)生。

不同的胞外信號肽誘導基因表達不同毒素，通過miRNA 調控mRNA 的翻譯[16]，使得不同毒素可以非同步合成并獨立分泌[17]，以避免細胞在同一時間生產所有毒素而造成壓力。

3 蛇毒的演化機制探討

自然界中動物毒素的功能主要是捕獵和防御。比如，蜜蜂及某些魚類的毒素主要發(fā)揮防御功能，防御性毒素是簡化和高度保守的，其主要作用是造成快速的、局部的劇痛；而捕食性毒素則更加復雜，在組成和生理學作用方面具有多樣性[18]。食肉錐型蝸牛（cone snails）[19]能在捕獵和防御模式間迅速轉化其毒素組分，毒素成分依據蝸牛的作用對象而調整：由防御引發(fā)的毒素包含大量癱瘓性毒素，作用于神經肌肉受體，能引起人體病理反應，對人類具有致死性；而由捕獵引發(fā)的毒素對于大多數人源性靶標則沒有活性，不能引起人類病理反應。

蛇毒的進化至少有6000 萬年[19]到1 億7000 萬年的歷史[20]，是迄今研究最深入的生物毒素系統(tǒng)。蛇毒對于蛇類具有捕食獵物和防御的雙重作用，捕食獵物是蛇毒的首要功能。蛇類為了能夠在特定環(huán)境（特別是食物）下生存，須與獵物相互角逐、相互影響、共同進化：一方面，獵物期望可以逃脫蛇毒的作用，免于被蛇類捕殺，進化出一些對毒素具有抗體的物質；另一方面，蛇類為了提高對生存環(huán)境的適應性，不斷優(yōu)化調整毒素組成，以最少量、最有效的毒素消耗為代價達到捕獲獵物的目的，毒素與獵物之間的“軍備競賽”持續(xù)進行。北太平洋響尾蛇（Crotalus o.orega?nus）的主要獵物是加利福尼亞松鼠（Otospermophi?lus beecheyi），Matthew 發(fā)現，松鼠血液中存在一種可以與蛇毒金屬蛋白酶結合的物質，使松鼠具備了一種天然抵抗蛇毒毒素的能力，而這種抗性是可以隨著地理差異的改變和蛇毒毒素成分的改變而調整的[21]。

生物毒素體現了生物的適應性，是趨異進化（divergent evolution）和趨同進化（convergent evo?lution）的很好的例子[20,22]。一些毒素基因被認為來源于參與重要的調控過程或具有生物活性的生理性蛋白基因的復制，并在毒腺中選擇性表達。一旦某個特殊的基因被招募到毒腺中，額外的基因復制發(fā)生，使得蛋白具有新功能或亞功能化，典型的可以產生大量的多位點基因家族，編碼不同功能和活性的毒素。同時，毒素也可以反向地從毒腺招募到正常組織中，一些毒素種類被發(fā)現在毒腺和組織中同時表達[23]。與組織中的酶類物質進化不同，蛇毒外顯子的進化速度明顯快于內顯子[24]，快速進化的殘基大多位于分子表面，以控制與靶標獵物體內的分子相互作用[25]。然而，毒素整體的進化速度是與毒素蛋白的轉錄組和蛋白質組的豐度相關的，高濃度的蛋白更可能被正向選擇[26]。

毒素基因通過基因復制和加速進化的方式賦予毒素新的或協(xié)同的功能[27]，是新毒素基因進化的主要模型，但這一過程同時也可以反向進行。Casewell 等認為，基因缺失可以改變蛇毒的生物活性，從而使毒素更適應環(huán)境[1]。Martinson等認為，毒素表達的缺失并非是基因的降解，而是由順式調控原件調節(jié)造成的基因表達下降引起的[28]。

現代科學技術的發(fā)展擴展了蛇毒研究的廣度和深度，取得了令人欣喜的成就，但是還有很多問題尚未完全明晰。隨著研究的不斷深入，對蛇毒組成、合成機制以及毒素生物演化機制還會有新的發(fā)現，這將有助于人類對蛇毒的利用，更好地揭示生命奧秘。