李哲，方明珠，陳紅，郭鋼花，范家宏，毛志娟

1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南鄭州市450052；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院，湖北武漢市430030

人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(human-induced pluripotent stem cells,iPSCs)是將特定的多能遺傳基因?qū)塍w細(xì)胞獲得的一種類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的多能干細(xì)胞。相比于胚胎干細(xì)胞，iPSCs來(lái)源充足，并具有疾病特異性，在多種疾病，如心血管疾病[1]、脊髓損傷[2]、腦卒中[3-4]、神經(jīng)退行性疾病[5-6]等的研究和治療中，具有廣泛潛能。

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是一種選擇性侵犯大腦皮層、腦干和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病，病因不明，目前尚無(wú)有效治療手段。肌萎縮側(cè)索硬化癥為最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，針對(duì)該病的細(xì)胞療法已進(jìn)入臨床前期實(shí)驗(yàn)，如利用患者體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞(NCT：02917681、02290886、01609283、02881489)和神經(jīng)干細(xì)胞(NCT：02943850、01730716)的移植，利用患者來(lái)源iPSCs建立疾病特異性細(xì)胞庫(kù)(NCT：00801333、02574390、00874783)以進(jìn)行機(jī)制研究。在實(shí)驗(yàn)室研究中，利用iPSCs分化為特定類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞，建立體外細(xì)胞[5]或動(dòng)物模型[7-8]為目前研究熱點(diǎn)。

培養(yǎng)iPSCs關(guān)鍵在于維持其未分化及無(wú)限增殖的特性，主要為有飼養(yǎng)層培養(yǎng)和無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)兩種方法。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)將iPSCs與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)飼養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生的多種因子，維持iPSCs的增殖，且保持其核型正常。但有飼養(yǎng)層培養(yǎng)需頻繁制備飼養(yǎng)層細(xì)胞以支持iPSCs生長(zhǎng)，增加了體外培養(yǎng)的工作量，且飼養(yǎng)層細(xì)胞本身可能攜帶及分泌異源性物質(zhì)，所培養(yǎng)的干細(xì)胞可引發(fā)人體免疫排斥，不適于臨床應(yīng)用[9-10]，因此無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法逐漸興起。

無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)使用細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞貼壁，用添加細(xì)胞因子的限定性培養(yǎng)基維持干細(xì)胞生長(zhǎng)。無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的最大特點(diǎn)是能夠減少或消除飼養(yǎng)層細(xì)胞所帶來(lái)的干擾。

兩種培養(yǎng)方法均可維持干細(xì)胞體外長(zhǎng)期增殖[11-12]。但關(guān)于不同培養(yǎng)方法干細(xì)胞神經(jīng)分化特性的研究仍較少，而誘導(dǎo)iPSCs獲得高純度神經(jīng)細(xì)胞是臨床及基礎(chǔ)研究中的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)利用有飼養(yǎng)層及無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法，結(jié)合Du等[13]的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化方案，利用不同小分子組合，經(jīng)誘導(dǎo)iPSCs 12 d，定向分化為特定類(lèi)型的神經(jīng)前體細(xì)胞——脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞(motor neuron precursor cells,MNP)，并在比較兩種體系中的分化效率，為后期優(yōu)化分化方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

iPSCs株由健康成年人外周血通過(guò)仙臺(tái)病毒重編程獲得。孕13.5 d CF1小鼠購(gòu)自上海斯萊克公司。

DMEM/F12、Neurobasal、Knockout血清替代物(Knockout serum substitute,KSR)、N2添加劑、B27添加劑、GlutaMAX、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、非必需氨基酸(nonessential amino acids,NEAA)、L-谷氨酰胺、胰酶：GIBCO公司。mTeSR1培養(yǎng)基：STEMMCELL公司。DMEM高糖：HYCLONE公司。β-巰基乙醇、抗壞血酸(ascorbic acid，AA)、Dispase、明膠、兔來(lái)源HOXA3多克隆抗體：SIGMA公司。重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)：PEPROTECH公司。山羊來(lái)源SOX1、SOX2多克隆抗體：RNDSYSTEMS公司。兔來(lái)源OLIG2多克隆抗體：MILLIPORE公司。兔來(lái)源OCT4抗體：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。兔來(lái)源PAX6抗體：BIOLEGEND公司。二抗均為INVITROGEN公司產(chǎn)品。CHIR99021(CHIR)、DMH1：TORCRIS 公 司 。SB431542(SB)、視 黃 酸 (retinoic acid,RA)、 Purmorphamine(Pur)：STEMGENT公司。熒光顯微鏡：NIKON公司。

1.2 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備

取出孕鼠宮內(nèi)胎鼠，分離全層皮膚組織，用鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶中作為P0細(xì)胞。細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右匯合時(shí)，1∶3傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P6～P10細(xì)胞，送輻照中心行γ射線照射。具體制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。飼養(yǎng)層細(xì)胞以3.5×105/孔密度接種至體積分?jǐn)?shù)0.1%明膠溶液包被的6孔板中，培養(yǎng)24 h后接種iPSCs。

1.3 iPSCs在有飼養(yǎng)層體系中的培養(yǎng)

有飼養(yǎng)層體系組成如下。①飼養(yǎng)層細(xì)胞：γ射線處理后的MEF。②無(wú)血清培養(yǎng)基，成分為78%DMEM/F12+10%KSR+1%NEAA+1 mmol/L Gluta-MAX+0.1 mmol/L β-巰基乙醇，使用時(shí)加入20 ng/ml bFGF。iPSCs于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天換液。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每5～6天用1 mg/ml Dispase消化傳代1次。iPSCs傳代時(shí)，需用槍頭刮去分化嚴(yán)重克隆，保證iPSCs狀態(tài)良好。

1.4 iPSCs在無(wú)飼養(yǎng)層體系中的培養(yǎng)

無(wú)飼養(yǎng)層體系組成如下：①細(xì)胞外基質(zhì)matrigel；②限定性培養(yǎng)基mTeSR1培養(yǎng)基。傳代前用Matrigel 37℃包被6孔板1 h。選取飼養(yǎng)層上待傳代且狀態(tài)良好的iPSCs克隆，機(jī)械切割后接種于6孔板中，換為mTeSR1培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天換液。每4～5天用1 mg/ml Dispase消化傳代1次。

1.5 MNP細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

分化過(guò)程主要經(jīng)過(guò)以下過(guò)程：①iPSCs向神經(jīng)上皮前體細(xì)胞(neuroepithelial progenitors,NEP)分化；②NEP向MNP分化。iPSCs傳代第2天記為分化第0天，加入含有小分子化合物CHIR、DMH1、SB的NEP培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)化尾側(cè)化分化，第6天獲得NEP細(xì)胞，表達(dá)尾側(cè)化神經(jīng)上皮細(xì)胞標(biāo)記物SOX1、HOXA3；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。第6天給予含RA及SHH激動(dòng)劑Pur的MNP培養(yǎng)基，誘導(dǎo)神經(jīng)上皮細(xì)胞尾側(cè)化和腹側(cè)化，分化第12天獲得MNP細(xì)胞，表達(dá)pMN區(qū)標(biāo)記物OLIG2；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為47%DMEM/F12+48%Neurobasal+0.5%N2+1%B27+1 mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 mmol/L AA；NEP培養(yǎng)基為分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+3 μmol/L CHIR+2 μmol/L SB+2 μmol/L DMH1；MNP 培養(yǎng)基為分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1 μmol/L CHIR+2 μmol/L SB+2 μmol/L DMH1+0.1 μmol/L RA+0.5 μmol/L Pur。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)

收集分化第6天和第12天細(xì)胞，Trizol法提取總RNA并測(cè)量濃度，定量5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并稀釋10倍。以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green Master Mix熒光染料法行RT-qPCR，檢測(cè)SOX1、HOXA、PAX6、OLIG2、SOX2、OCT4基因水平。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火 30 s，循環(huán) 40 次。所用引物序列見(jiàn)表 1。2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次，取均值。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 免疫熒光染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)

iPSCs在體外培養(yǎng)5代后，行多能性標(biāo)記物OCT4、SOX2染色；誘導(dǎo)第6天，行SOX1、HOXA3熒光染色；誘導(dǎo)第12天，行OLIG2、OCT4、PAX6熒光染色。

4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%Triton-X-100破膜10 min，驢血清室溫封閉1 h，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗：SOX1 1∶500、SOX2 1∶40、HOXA3 1∶1000、 OLIG2 1∶ 500、 OCT4 1∶ 500、 PAX6 1∶1000。濕盒中4℃過(guò)夜。12 h后棄一抗，加入適當(dāng)比例稀釋的二抗：Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗山羊lgG 1∶1000、驢抗兔lgG 1∶1000；Alexa Fluor 594標(biāo)記驢抗山羊lgG 1∶1000、驢抗兔lgG 1∶1000。室溫避光處理50 min，加入DAPI核染10 min。甘油封片，熒光顯微鏡下拍照。每組選兩張玻片，每張玻片隨機(jī)選5個(gè)非重疊視野，行陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每張玻片平均陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組數(shù)據(jù)來(lái)自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，以(xˉ±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)

在有飼養(yǎng)層體系中，iPSCs呈克隆狀生長(zhǎng)，克隆為圓形或橢圓形，邊界清晰；克隆內(nèi)細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞核大、核仁清晰，核質(zhì)比較高。無(wú)飼養(yǎng)層體系中，iPSCs扁平貼壁生長(zhǎng)，形成不規(guī)則形細(xì)胞克隆；克隆內(nèi)細(xì)胞排列松散，核質(zhì)比較高。

分化第6天，有飼養(yǎng)層細(xì)胞核質(zhì)比下降，克隆中央細(xì)胞堆積增厚，出現(xiàn)早期花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞核質(zhì)比下降，細(xì)胞單層致密生長(zhǎng)，無(wú)特異性結(jié)構(gòu)。

圖1 兩種體系下培養(yǎng)的iPSCs、NEP和MNP(倒置顯微鏡，100×)

分化第12天，有飼養(yǎng)層細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列成典型玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，花環(huán)中央出現(xiàn)空心結(jié)構(gòu)，花環(huán)之間分界清晰。無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞同樣出現(xiàn)花環(huán)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈單層緊密排列，無(wú)明顯立體結(jié)構(gòu)，花環(huán)之間分界較模糊。兩種體系下克隆邊緣均有未分化單層細(xì)胞殘留。見(jiàn)圖1。

2.2 免疫熒光染色

iPSCs體外培養(yǎng)5代后，均表達(dá)多能性抗原SOX2、OCT4(圖2)。分化第6天，細(xì)胞均表達(dá)NEP標(biāo)記物SOX1及尾側(cè)化標(biāo)記HOXA3(圖3)。分化第12天，細(xì)胞均表達(dá)MNP相關(guān)標(biāo)記物OLIG2、PAX6，低表達(dá)多能性標(biāo)記物OCT4(圖4)。有飼養(yǎng)層細(xì)胞SOX1、HOXA3、OLIG2陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞(p＜0.01)。OCT4表達(dá)量均極低，且無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 相關(guān)基因表達(dá)

分化第6天，有飼養(yǎng)層培養(yǎng)的NEP細(xì)胞SOX1和HOXA3基因表達(dá)明顯高于無(wú)飼養(yǎng)層(p＜0.01)；分化第12天，有飼養(yǎng)層培養(yǎng)的MNP細(xì)胞OLIG2和OCT4表達(dá)水平顯著高于無(wú)飼養(yǎng)層(p＜0.001)；SOX2和PAX6表達(dá)兩組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表2 兩組細(xì)胞標(biāo)記蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率(%)

圖2 兩種體系下培養(yǎng)細(xì)胞多能性抗原表達(dá)(免疫熒光染色，200×)

圖3 兩種體系下培養(yǎng)細(xì)胞NEP標(biāo)記抗原表達(dá)(免疫熒光染色，200×)

圖4 兩種體系下培養(yǎng)細(xì)胞MNP標(biāo)記抗原及多能性抗原表達(dá)(免疫熒光染色)

表3 兩組細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)比較(2-ΔΔCt)

3 討論

iPSCs是可以分化為三個(gè)胚層的多潛能干細(xì)胞，將其分化為特定區(qū)域神經(jīng)元或神經(jīng)前體細(xì)胞，為目前研究熱點(diǎn)。

通過(guò)小分子可逐步誘導(dǎo)iPSCs向特定區(qū)域神經(jīng)元分化。CHIR為Wnt信號(hào)激動(dòng)劑，DMH1和SB分別為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)及Activin/Nodal通路抑制劑，三者共同作用可誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)尾側(cè)化分化，使細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)發(fā)育早期標(biāo)志物SOX1及尾側(cè)化標(biāo)志物HOXA3。

神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，pMN區(qū)域產(chǎn)生所有的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[15]，Pur為SHH通路激動(dòng)劑，適當(dāng)濃度可誘導(dǎo)神經(jīng)上皮向脊髓腹側(cè)pMN區(qū)神經(jīng)元分化。OLIG2是脊索腹側(cè)pMN區(qū)域的重要標(biāo)記，OLIG2基因敲除后，pMN區(qū)域缺失，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺失[16-17]。目前公認(rèn)OLIG2蛋白為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性標(biāo)志物。

本研究顯示，兩種體系下iPSCs均能有效分化為MNP，但有飼養(yǎng)層分化效率更高。Gong等[18]報(bào)道，飼養(yǎng)層細(xì)胞能分泌白血病抑制因子和bFGF等多種生長(zhǎng)因子。MEF較其他飼養(yǎng)層細(xì)胞可以更好維持胚胎干細(xì)胞正常核型[19]，促進(jìn)神經(jīng)上皮發(fā)生。飼養(yǎng)層細(xì)胞作為iPSCs的細(xì)胞外基質(zhì)，也為細(xì)胞本身維持和神經(jīng)發(fā)生提供良好微環(huán)境，對(duì)NEP及MNP的發(fā)生起到促進(jìn)和支持作用。

然而，有飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系限制了iPSCs的批量擴(kuò)增，且引入的動(dòng)物源性細(xì)胞增加免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。Martin等[20]報(bào)道，MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞可以表達(dá)非人源的唾液酸，引起人體免疫應(yīng)答。目前iPSCs的無(wú)異源性培養(yǎng)體系有較多研究[21-23]，如利用人血清衍生蛋白代替飼養(yǎng)層細(xì)胞，建立無(wú)異源性iPSCs培養(yǎng)體系[24]。然而這些體系中所用的蛋白或細(xì)胞來(lái)源有限，成本昂貴，不利于細(xì)胞批量生產(chǎn)，且各種體系下培養(yǎng)的細(xì)胞向特定類(lèi)型細(xì)胞的分化效率需進(jìn)一步研究。

分化過(guò)程中，多能標(biāo)記蛋白OCT4表達(dá)下調(diào)，有飼養(yǎng)層MNP中OCT4基因轉(zhuǎn)錄水平高于無(wú)飼養(yǎng)層。OCT4蛋白為細(xì)胞多能性標(biāo)志物，Wnt通路在維持干細(xì)胞多能性中發(fā)揮重要作用[25]，Wnt經(jīng)典通路中核心蛋白β-Catenin可增強(qiáng)OCT4的活性[26]。而在飼養(yǎng)層不同的培養(yǎng)條件下，人胚胎干細(xì)胞Wnt信號(hào)起始狀態(tài)存在差異，可能對(duì)細(xì)胞分化和相關(guān)信號(hào)通路的研究結(jié)果有較大影響[27]。推測(cè)兩種體系中Wnt信號(hào)通路初始狀態(tài)的差異，使有飼養(yǎng)層培養(yǎng)細(xì)胞后期OCT4轉(zhuǎn)錄水平高于無(wú)飼養(yǎng)層。

在細(xì)胞分化的不同階段加入小分子化合物組合，可以在有飼養(yǎng)層及無(wú)飼養(yǎng)層體系中同時(shí)獲得特定區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞——MNP，且有飼養(yǎng)層體系中分化效率更高。但飼養(yǎng)層細(xì)胞增加了后期免疫排斥的概率，不利于細(xì)胞移植。無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系減少了異源性細(xì)胞的介入，可進(jìn)行iPSCs的批量擴(kuò)增及分化。如何利用低或無(wú)免疫原性的培養(yǎng)體系獲得大量神經(jīng)前體細(xì)胞，仍需進(jìn)一步嘗試。

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