孔英戈，汪 華，張少云，潘 萍

（衡陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽 421001）

巴氯芬（baclofen，氯苯氨丁酸）為解痙藥，是γ-氨基丁酸（GABA）的衍生物，為作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦和脊髓的骨骼肌松弛劑、鎮(zhèn)靜劑[1]。巴氯芬是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的選擇性GABAB受體激動(dòng)劑，曾作為肌松藥用于臨床，近年來又發(fā)現(xiàn)了許多新的應(yīng)用，如鎮(zhèn)咳、抗癲癇、治療頑固性呃逆、中風(fēng)及脊髓損傷引起的疼痛、三叉神經(jīng)痛等。在腦血管病康復(fù)期，應(yīng)用巴氯芬也取得良好效果，采用巴氯芬治療胃食管反流病開辟了非抑胃酸治療胃食管反流病的新途徑[2]。巴氯芬的結(jié)構(gòu)式為：

2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯是合成巴氯芬的關(guān)鍵中間體[3]，其含量和穩(wěn)定性直接決定最終產(chǎn)物巴氯芬的質(zhì)量和產(chǎn)量，而目前未見該中間體相關(guān)分析方法的報(bào)道。因此，研究巴氯芬關(guān)鍵中間體2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的定量分析檢測(cè)方法是非常必要和重要的。2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的結(jié)構(gòu)式為：

高效液相色譜法（HPLC）是色譜分析法的一個(gè)分支，是近年來藥物分析中發(fā)展較快，已占主導(dǎo)地位的分離、分析方法[4-7]。其特點(diǎn)是分析速度快、分離效率高、檢測(cè)靈敏度高、適用范圍廣、組分易回收等，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥物成分含量測(cè)定、組成分析和質(zhì)量控制等方面[8]。本研究采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），利用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）定量檢測(cè)分析巴氯芬的關(guān)鍵中間體2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260 Infinity四元液相色譜系統(tǒng)，包括1260 Quat pump（四元低壓混合泵）、在線真空脫氣機(jī)、1260 ALS自動(dòng)液體進(jìn)樣器、1260 TCC柱溫箱和1260DAD全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)器；全玻璃溶劑過濾器AUTO SCIENCE。

甲醇：色譜純（HPLC級(jí)），經(jīng)0.2 μm孔徑油相濾膜過濾處理；水：實(shí)驗(yàn)室二級(jí)純水，經(jīng)0.2 μm孔徑水相濾膜過濾處理；2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.0%）。

1.2 色譜條件

色譜柱：WAT054275 Waters Symmetry（ 250 mm×4.6 mm，5 μm）不銹鋼柱，內(nèi)裝C18（5μm）鍵合固定相；流動(dòng)相：甲醇-水（70+30）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：319 nm；柱溫：40.0℃；流量：1 mL/min；進(jìn)樣量：20.0 μL；典型保留時(shí)間：7.5 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜柱的選擇

為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的有效分離與測(cè)定，滿足檢測(cè)重現(xiàn)性要求，比較和選擇適宜目標(biāo)化合物的色譜柱。試驗(yàn)選擇比較了WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SB（Stable Bond） C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、島津C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 分 離峰 對(duì) 稱性 較好，重現(xiàn)性較優(yōu)異。本工作選擇WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分離分析柱。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取約0.05 g（準(zhǔn)確到0.000 2 g）2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲處理后，待樣品完全溶解并冷卻至室溫后用甲醇定容。搖勻后，用移液管準(zhǔn)確移取1.0 mL溶液于另一只25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，振蕩搖勻。用0.45 μm濾膜過濾備用。

1.3.3 試樣溶液的配制

試樣溶液的配制：稱取約0.05 g（準(zhǔn)確到0.000 2 g）2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯待測(cè)樣品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲處理后，待樣品完全溶解并冷卻至室溫后用甲醇定容。搖勻后，用移液管準(zhǔn)確移取1.0 mL溶液于另一只25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，振蕩搖勻。用0.45 μm濾膜過濾備用。

在上述條件下，待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，連續(xù)注入幾針標(biāo)樣溶液，計(jì)算各針相應(yīng)值的重復(fù)性，待相鄰兩針的相對(duì)響應(yīng)值變化小于0.5%以后，按標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液順序進(jìn)行色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對(duì)樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，其色譜圖如圖1所示。

圖1 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的液相色譜圖

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)190～590 nm全波段掃描，2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯在200～250 nm范圍內(nèi)都有較強(qiáng)的紫外吸收（見圖2），在319 nm左右處吸收最強(qiáng)且此時(shí)雜質(zhì)和主峰吸收均較理想。因此，選擇319 nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯在流動(dòng)相甲醇-水（30:70）時(shí)，保留時(shí)間較短，甲醇-水（5:95）時(shí)，保留時(shí)間長(zhǎng)，分離效果較差；在比例為（10:90）時(shí)能6 min內(nèi)出峰，但分離效果和峰形不好。在甲醇-水（70:30）時(shí)，無論是保留時(shí)間、分離效果還是峰形都比較好。因此，試驗(yàn)選擇甲醇-水為流動(dòng)相，流動(dòng)相比為（70:30）。

圖2 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的紫外掃描光譜圖

2.4 方法的線性范圍

按照1.3.2稱取0.05 g標(biāo)準(zhǔn)品配制成溶液后分別用移液管準(zhǔn)確移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容并搖勻過濾。在1.2色譜條件下測(cè)定，其結(jié)果如表1所示。

表1 線性關(guān)系的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表1結(jié)果繪制線性回歸曲線，如圖3所示。線性方程為y=106x+252 987，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 5，從中可看出方法的線性范圍較寬。

圖3 2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度的測(cè)定

用同一樣品在色譜條件下進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果如表2所示。表2結(jié)果說明，該方法的精密度較好。

2.6 回收率的測(cè)定

將2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品加入已知2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯含量的樣品中，在色譜條件下測(cè)定其回收率，結(jié)果如表3所示。

從表3可知，回收率在98.6%～100.8%，說明方法的準(zhǔn)確性很好。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，采用高效液相色譜法，能夠滿足對(duì)2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的定量分析要求。

表2 精密度的測(cè)定結(jié)果

表3 回收率的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法建立了2-[1-（4-氯苯基）2-硝基乙基]丙二酸二甲酯的外標(biāo)法定量分析方法。該方法利用WAT054275 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水（70:30），流速1 mL/min，使用二極管陣列檢測(cè)器于319 nm測(cè)定，并且樣品雜質(zhì)不干擾測(cè)定。這種方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.34%，變異系數(shù)為0.35%，線性范圍較寬，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，樣品加標(biāo)回收率為98.6%～100.8%，定量分析檢測(cè)結(jié)果滿意。

1 謝瑞滿.巴氯芬臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2006，（3）：149-153.

2 汪萌芽，朱 蓉.解痙藥巴氯芬研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1992，（5）：335-339.

3 端振英.R（-）-巴氯芬的合成及中間體（±）-GAM的拆分[D].河北：河北醫(yī)科大學(xué)，2003.

4 成都科學(xué)技術(shù)大學(xué)分析化學(xué)教研室.分析化學(xué)手冊(cè)（第四冊(cè)下冊(cè) 光譜分析）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1984.

5 The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopoeia X XⅢ[S].Washington，DC：The United States Pharmacopeial Convention，2012.

6 British Pharmacopoeia Commission.British Phavmacopia[S].London：British Pharmacopoeia Commission，2002.

7 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

8 竹葉晉，張 杰.HPLC-EISD在藥物分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J].贛南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，12（6）：39-41.