(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266100)

帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，該病典型臨床癥狀為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙[1]。其病理特點(diǎn)是中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失，以及α突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體的形成[2]。已有研究表明，炎癥、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等參與了PD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3-5]。這些為PD的治療提供了新的靶點(diǎn)。

P2X4受體是一種三聚體的通道蛋白的嘌呤受體，在大腦、脊髓組織中均有廣泛分布，P2X4受體在T淋巴細(xì)胞上也有表達(dá)，有促進(jìn)T細(xì)胞活化及抗原呈遞作用[6]。小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后可發(fā)揮巨噬細(xì)胞的功能，激活包括P2X4受體在內(nèi)的多種受體，促進(jìn)多種炎性因子釋放，此過(guò)程參與了神經(jīng)病理性疼痛、癲癇等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[7-8]。神經(jīng)炎癥是PD的重要發(fā)病機(jī)制之一，我們推斷在PD的動(dòng)物模型中P2X4參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活過(guò)程，從而介導(dǎo)PD的發(fā)病。本研究通過(guò)觀察6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的PD模型大鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量以及測(cè)定P2X4、半胱氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)、α-synuclein蛋白的表達(dá)水平，探討P2X4對(duì)PD模型大鼠黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的潛在影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠120只(購(gòu)于青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量200～250 g，單籠飼養(yǎng)，置于(20±2)℃室溫，大鼠自由飲水、攝食。將120只大鼠隨機(jī)分為6組(每組20只)，分別為對(duì)照組(A組)、6-OHDA組(B組)、P2X4-NC組(C組)、siRNA-P2X4+6-OHDA組(D組)、siRNA-P2X4組(E組)、P2X4-NC+6-OHDA(F組)。大鼠完全適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 器材與試劑

冷凍切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))；腦立體定位儀(瑞沃德公司，中國(guó))；熒光顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))；PCR儀(ABI，美國(guó))；10 μL微量注射器(Stoelting，美國(guó))；P2X4慢病毒(吉?jiǎng)P公司)；P2X4抗體(Alamnelabs，以色列)；caspase-1抗體(Abcam公司，英國(guó))；α-synuclien抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó))；TH抗體(Millipore，美國(guó))；驢抗兔熒光二抗(Life Technologies，美國(guó))；6-OHDA、阿撲嗎啡(APO)(Sigma，美國(guó))；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Qiagen，德國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國(guó))；Trizol(Takara，日本)。

1.3 PD模型大鼠的制備

各組大鼠稱體質(zhì)量后，以100 g/L水合氯醛按400 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉；備皮后將大鼠牢固固定在立體定位儀上，經(jīng)碘附和乙醇消毒后，由頭部的正中矢狀位切開(kāi)頭皮，露出前囟。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[9]，定位左側(cè)黑質(zhì)(前囟后5.0 mm，中線左側(cè)2.1 mm，深度7.7 mm)，用牙科鉆在已定好位置鉆孔，隨后用微量注射器吸取0.3 μL陰性對(duì)照慢病毒或攜帶目的基因的慢病毒在大鼠左側(cè)黑質(zhì)處定位注射，針頭滯留5 min后緩慢拔出。A組、B組、C組、E組分別通過(guò)立體定位儀用微量注射器向大鼠左側(cè)黑質(zhì)注射生理鹽水、6-OHDA、攜帶空載siRNA的慢病毒、攜帶抑制P2X4表達(dá)的目的siRNA-P2X4慢病毒；D組、F組分別注射攜帶抑制P2X4表達(dá)的目的siRNA-P2X4慢病毒和攜帶空載siRNA的慢病毒，2周后進(jìn)行6-OHDA(4 g/L)黑質(zhì)內(nèi)注射。

1.4 成模標(biāo)準(zhǔn)

完成上述實(shí)驗(yàn)操作后2周，腦內(nèi)注射6-OHDA的大鼠向腹腔內(nèi)注射濃度為0.5 g/L的APO，劑量為0.5 mg/kg，10 min后觀察并記錄大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，觀察60 min，平均轉(zhuǎn)速>6 r/min為成功模型，否則為不成功模型。剔除死亡及造模失敗的大鼠后，A、B、C組均剩余16只大鼠，D、E、F組均剩余15只大鼠。

1.5 Western blot法檢測(cè)P2X4、caspase-1、α-synuclein蛋白的表達(dá)

將6組大鼠各取10只以100 g/L水合氯醛腹腔麻醉后斷頭取腦，取左側(cè)黑質(zhì)組織，分別置于EP管中，每個(gè)EP管內(nèi)加入200 μL細(xì)胞裂解液(其中含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)，研磨棒研磨組織，置于冰上裂解30 min后，置于低溫離心機(jī)中(4 ℃條件下)12 000 r/min離心15 min后提取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白的含量。取1μL蛋白樣品用0.01 mol/L的PBS稀釋至20 μL，加入96孔板中，將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至標(biāo)準(zhǔn)品孔中，用0.01 mol/L的PBS補(bǔ)足至20 μL。BCA試劑A和試劑B依照50∶1的比例配制BC工作液。各孔內(nèi)均加入200 μL BC工作液，在烤箱中放置30 min，溫度37 ℃，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。蛋白樣品中加入上樣緩沖液(2×Loading buffer)后充分混勻，100 ℃條件下煮10 min。以SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，蛋白上樣(上樣量為每孔20 μg)后，恒壓80 V條件下電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后將恒壓調(diào)整為120 V，時(shí)間約60 min。將分離好的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，后恒電流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min。以體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂牛奶室溫封膜2 h，分別添加一抗孵育(anti-P2X4，1∶200；anti-TH，1∶4 000；anti-caspase-1，1∶2 000；anti-GAPDH，1∶10 000)，4 ℃搖床過(guò)夜。第2天用PBST洗滌3次，加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶10 000)后室溫下?lián)u床孵育1 h，PBST洗滌3次進(jìn)行顯影，用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的蛋白與GAPDH條帶灰度的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平，所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 免疫熒光染色

參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[10]。各組剩余大鼠稱體質(zhì)量后以100 g/L水合氯醛麻醉，用生理鹽水及40 g/L的多聚甲醛溶液經(jīng)左心室灌注固定后斷頭，取腦組織后在40 g/L多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h，分別在200 g/L蔗糖溶液、300 g/L蔗糖溶液中脫水后，置于-80 ℃冰箱保存。在鼠腦冠狀位連續(xù)切片時(shí)，冷凍切片機(jī)切片調(diào)整為厚度20 μm，溫度為-20 ℃，采用細(xì)針將冷凍切片輕輕粘至加入0.01 mol/L的PBS的24孔板中，盡量避免損傷腦組織。冷凍切片剝離皮質(zhì)部位后采用PBST沖洗，加入TH一抗(1∶2 000)、α-synuclein一抗(1∶1 000)、caspase-1一抗(1∶500)，置于4 ℃搖床孵育過(guò)夜。用PBST反復(fù)沖洗3次，每次持續(xù)5 min。加驢抗兔熒光二抗(1∶500)，室溫避光搖床孵育2 h后再次用PBST沖洗3次，每次持續(xù)5 min。避光貼片，腦片周圍自然干燥后用700 g/L甘油溶液封片，鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠黑質(zhì)中P2X4、α-synuclein、caspase-1的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組和F組大鼠黑質(zhì)內(nèi)P2X4表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=111.9，P<0.01)；C組、D組大鼠黑質(zhì)內(nèi)P2X4表達(dá)較F組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與A組比較，B組大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-synuclein的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.9，P<0.01)；D組大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-synuclein表達(dá)較F組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與A組比較，B組大鼠黑質(zhì)內(nèi)caspase-1表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=141.3，P<0.01)；D組大鼠黑質(zhì)內(nèi)caspase-1蛋白表達(dá)較F組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 各組大鼠黑質(zhì)中TH陽(yáng)性的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，干擾慢病毒在黑質(zhì)TH陽(yáng)性的多巴胺能神經(jīng)元中穩(wěn)定表達(dá)(圖2)。與A組比較，B組和F組黑質(zhì)TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.16，P<0.01)；與F組比較，C組和D組大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與A比較，C組和E組大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。見(jiàn)表1，圖3。

組別P2X4α?synucleincaspase?1TH陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元數(shù)量A組0．596±0．0150．652±0．0330．562±0．0167363．0±171．7B組1．129±0．0371．254±0．0341．064±0．0215320．0±269．0C組0．678±0．0350．536±0．0170．666±0．0186940．0±141．5D組0．841±0．0381．071±0．0400．784±0．0256132．0±165．7E組0．458±0．0170．594±0．0190．734±0．0117250．0±246．0F組1．232±0．0231．337±0．0231．204±0．0304799．0±203．7

圖1 各組大鼠中α-synuclein、P2X4、caspase-1蛋白的表達(dá)

A為TH在大鼠黑質(zhì)中表達(dá)情況；B為重組慢病毒在大鼠黑質(zhì)中表達(dá)情況；C為重組慢病毒在TH陽(yáng)性的多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá)情況。TH染色，400倍。

圖2TH陽(yáng)性的多巴胺能神經(jīng)元慢病毒的轉(zhuǎn)染情況

①、②、③、④、⑤、⑥分別為A、B、C、E、D、F組。TH染色，100倍。

3 討 論

PD的典型病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失、以α-synuclein為主要成分的路易小體形成以及紋狀體多巴胺水平降低[11]。尸檢發(fā)現(xiàn)，PD病人的黑質(zhì)中有大量活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞，而且活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與神經(jīng)變性程度呈正比[12-13]。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)α-synuclein有很強(qiáng)的內(nèi)吞、降解作用，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，對(duì)α-synuclein的降解作用降低，未被降解的α-synuclein可發(fā)生錯(cuò)誤的折疊而異常沉積在胞質(zhì)內(nèi)，造成小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步激活[14]。這種正向的反饋使α-synuclein持續(xù)沉積，造成細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體囊泡運(yùn)輸障礙，增加多巴胺神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，加快多巴胺能神經(jīng)元的死亡進(jìn)程[15]。

P2X4受體作為一種分布廣泛的嘌呤能受體，在大腦、脊髓、自主和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)和垂體前葉均有分布[16]。P2X4異常的上調(diào)及活化引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與神經(jīng)退行性疾病也有一定關(guān)系[17-19]。P2X4受體激活后可誘導(dǎo)下游的信號(hào)通路激活，從而調(diào)控前列腺素、IL-1、TNF-α、IL-6、caspase-1等炎性因子活化，參與包括周圍炎癥性疼痛、糖尿病腎間質(zhì)性炎癥、癲癇等疾病的病理過(guò)程[20]。最新研究表明，P2X4受體通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與了慢性乙醇中毒引起的神經(jīng)退行性損傷的炎性發(fā)病機(jī)制[21]，我們推測(cè)P2X4表達(dá)上調(diào)可能也參與了PD的發(fā)生過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型中，大鼠黑質(zhì)中P2X4、α-synuclein的蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組有所升高，PD模型中黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯下降，這些結(jié)果表明P2X4可能參與了PD的發(fā)病過(guò)程。使用抑制P2X4表達(dá)的慢病毒預(yù)處理后，大鼠黑質(zhì)中P2X4蛋白表達(dá)較PD組有所下降，TH陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量上升，說(shuō)明干擾P2X4表達(dá)可抑制TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元的死亡，大鼠黑質(zhì)中α-synuclein的蛋白水平較PD組下降，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高，進(jìn)一步驗(yàn)證P2X4表達(dá)下調(diào)可起到神經(jīng)保護(hù)作用。為了明確P2X4表達(dá)下調(diào)在PD的炎癥機(jī)制中的具體作用機(jī)制，本研究還對(duì)caspase-1蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。caspase家族是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，不僅在炎癥反應(yīng)中起重要作用，而且介導(dǎo)了某些特定類型細(xì)胞的凋亡。caspase-1可被炎癥小體激活，通過(guò)切割I(lǐng)L-1β、IL-18前體，促進(jìn)多種炎癥因子釋放參與炎癥反應(yīng)[22]。已有研究表明，caspase-1與α-synuclein的聚集與神經(jīng)細(xì)胞毒性作用有直接關(guān)系[23]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各組大鼠之間黑質(zhì)中P2X4、α-synuclein與caspase-1蛋白結(jié)果的變化是基本同步的，P2X4表達(dá)下調(diào)可直接或間接下調(diào)caspase-1的表達(dá)，由此推斷P2X4表達(dá)下調(diào)可通過(guò)抑制caspase-1的表達(dá)來(lái)減少α-synuclein的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量以及P2X4、α-synuclein、caspase-1蛋白表達(dá)量的變化，證實(shí)P2X4在PD模型發(fā)病機(jī)制中具有一定作用，P2X4表達(dá)下調(diào)能夠影響α-synuclein的表達(dá)，對(duì)大鼠黑質(zhì)內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元起保護(hù)作用，這為PD的病因治療提供了新的思路。

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