豐 航，陳德妙，李 榮，單 敏

(1.陜西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710068；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054)

鹽酸氨基葡萄糖(分子式 C6H13NO5·HCl)是甲殼素降解后生成的一種還原糖，又稱D-葡萄糖胺鹽酸鹽(D-glucosamine hydrochloride，GAH)，是存在于機體內(nèi)尤其是關(guān)節(jié)軟骨中的氨基單糖，可刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生正常多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白多糖，對骨性關(guān)節(jié)炎具有很好的療效[1-2]，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于葡維氨糖膠囊中；維生素C是人體必需的營養(yǎng)元素，具有抗氧化、強身健腦、促進(jìn)骨膠原生物合成等功效，葡維氨糖膠囊中將二者結(jié)合用作增強關(guān)節(jié)免疫能力、促進(jìn)軟骨創(chuàng)傷的愈合。目前，常用的鹽酸氨基葡萄糖含量檢測方法主要有HPLC法[3-9]、紫外-可見分光光度法[10-11]和液質(zhì)聯(lián)用法[12]；而維生素C常用的檢測方法為比色法、熒光法及高效液相色譜-紫外檢測器法[13-20]。尚未見同時檢測該2種成分的文獻(xiàn)報道。本文將利用鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的電導(dǎo)性質(zhì)，采用離子色譜對其進(jìn)行分離，借助電導(dǎo)檢測器同時進(jìn)行二者的含量測定。該法操作簡單、靈敏度高、專屬性強、準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好，可為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ICS-3000離子色譜儀(美國戴安公司)，配有電導(dǎo)檢測器。

1.2試藥 鹽酸氨基葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號140649-201304，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)，抗壞血酸對照品(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號111706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9% )；水為超純水；葡維氨糖膠囊(威?？祵毶锟萍加邢薰?，批號541016406)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 分別精密稱取100 mg鹽酸氨基葡萄糖對照品和100 mg抗壞血酸(即維生素C)對照品，分別置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，作為對照品儲備液。精密吸取該溶液各25 mL混合，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為50，100，200，300，400和500 μg·mL-1的溶液，作為混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液 取適量膠囊內(nèi)容物，用研缽研細(xì)，混勻，稱取25 mg，置于100 mL量瓶中，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3陰性樣品溶液 取適量不含鹽酸氨基葡萄糖和維生素C的陰性樣品，用研缽研細(xì)，混勻，稱取25 mg，置于100 mL量瓶中，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為陰性樣品溶液。

2.1.4溶劑空白溶液 取100 mL水，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為溶劑空白溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Ion Pac AS-19(250 mm×4 mm)；保護(hù)柱：Ion Pac AG-19(50 mm×4 mm)；淋洗液：10 mmol·L-1氫氧化鉀溶液(在線淋洗液發(fā)生器生成)；抑制電流：25 mA；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測器：電導(dǎo)檢測器；進(jìn)樣量：25 μL。色譜圖見圖1。

圖1離子色譜圖

A.對照品溶液；b.供試品溶液；c.陰性樣品溶液；d.溶劑空白溶液；1.維生素C；2.鹽酸氨基葡萄糖。

Fig.1 Ion chromatograms

A.reference substances solution;b.sample solution;c.negative solution;d.solvent blank solution；1.vitamin C；2.glucosamine hydrochloride.

2.3測定法 分別取2.1項下制備的對照品溶液和供試品溶液適量，按照2.2項下色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)保留時間定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2.4線性關(guān)系考察 取2.1.1項下不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別進(jìn)樣25 μL，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸氨基葡萄糖回歸方程為y=0.039 4x-0.286 2，r=0.999 9；維生素C的回歸方程為y=0.037 4x-0.242 7，r=0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸氨基葡萄糖與維生素C質(zhì)量濃度在50～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察 取質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次25 μL，記錄峰面積及保留時間。鹽酸氨基葡萄糖與維生素C 峰面積的RSD值分別為0.33%和0.35%，保留時間RSD值分別為0.12%和0.17%，結(jié)果表明，二者精密度均良好。

2.6重復(fù)性考察 取同一批號供試品，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照2.2項下方法進(jìn)樣測定，6份樣品鹽酸氨基葡萄糖與維生素C含量的RSD 值分別為1.12%和1.25%，結(jié)果表明，重復(fù)性均良好。

2.7穩(wěn)定性考察 取已經(jīng)制備好的供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，18和24 h進(jìn)樣，記錄鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的峰面積,計算得RSD值分別為1.85%和2.57%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率考察 精密稱取已測含量的葡維氨糖膠囊9份，各25 mg(分為3個水平，每個水平3平行)，分別置于100 mL量瓶中。3個水平分別精密加入鹽酸氨基葡萄糖對照品儲備液(質(zhì)量濃度為1.008 mg·mL-1)各13.5，17.0和20 mL以及維生素C對照品儲備液(質(zhì)量濃度為1.004 mg·mL-1)各1.0，1.3和1.6 mL，加入80 mL水超聲溶解，用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為回收率實驗待測溶液。經(jīng)計算，鹽酸氨基葡萄糖平均回收率為98.91%，RSD值為0.62%；維生素C平均回收率為98.46%，RSD值為0.88%。見表1～2。

表1鹽酸氨基葡萄糖回收率實驗結(jié)果

Tab.1 The results of glucosamine hydrochloride recovery test

序號加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%113.613.599.2698.910.62213.613.498.53313.613.498.53417.116.998.83517.116.998.83617.116.797.66720.220.199.50820.220.199.50920.220.199.50

表2維生素C回收率實驗結(jié)果

Tab.2 The results of vitamin C recovery test

序號加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%11.001.01101.0099.460.8821.001.00100.0031.001.00100.0041.311.3099.2451.311.31100.0061.311.3099.2471.611.5998.7681.611.5998.7691.611.5898.14

2.9檢測限和定量限 取2.1.1項下制備的混合對照品儲備液，用水稀釋制成不同質(zhì)量濃度的溶液，按照2.2項下色譜條件進(jìn)行測定，按照S/N≥3計算鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測質(zhì)量濃度均為0.1 μg·mL-1；維生素C的最低檢測質(zhì)量濃度均為0.2 μg·mL-1；按照S/N≥10計算鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測質(zhì)量濃度為0.3 μg·mL-1；維生素C的最低檢測質(zhì)量濃度為0.6 μg·mL-1。

2.10供試品測定 按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別測定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖與維生素C的含量。結(jié)果顯示，葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量為238.0 mg·粒-1；維生素C的含量為18.23 mg·粒-1。

3 討論

3.1檢測方法的選擇 鹽酸氨基葡萄糖的常用含量檢測方法主要有HPLC法、紫外-可見分光光度法和液質(zhì)聯(lián)用法。由于該化合物在紫外區(qū)缺乏特征吸收，故在利用HPLC法時，只能采用紫外檢測器(紫外末端吸收法或柱前衍生法)或蒸發(fā)管檢測器進(jìn)行測定。采用紫外末端吸收法靈敏度較低；蒸發(fā)光檢測器法雜質(zhì)干擾大；而柱前衍生法操作繁瑣。利用紫外-可見分光光度法對復(fù)雜樣品進(jìn)行測定時，選擇性很難達(dá)到要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在儀器方面成本投入過大，不利于推廣。維生素C目前常用的檢測方法為比色法、熒光法及高效液相色譜-紫外檢測器法，比色法和熒光法對于復(fù)雜化合物的測定選擇性較差；采用高效液相色譜-紫外檢測器法則很難與測定鹽酸氨基葡萄糖相兼容。但鹽酸氨基葡萄糖與維生素C均為水溶性化合物，具有導(dǎo)電性。利用這2種化合物的這一性質(zhì)，本文選用離子色譜法-電導(dǎo)檢測器對其進(jìn)行分離、測定。

3.2離子色譜柱的選擇 鹽酸氨基葡萄糖與維生素C在其水溶液中均呈陰離子，帶有負(fù)電荷。故采用Ion Pac AS-19陰離子交換柱(250 mm×4 mm)即可實現(xiàn)對該陰離子的分離。由于樣品處理方法較為簡單，僅為加水超聲溶解，故在分離柱前增加同型號的預(yù)柱Ion Pac AG-19(50 mm×4 mm)進(jìn)行柱保護(hù)。

3.3國標(biāo)液相方法與本法比較 現(xiàn)行的鹽酸氨基葡萄糖測定方法為GB/T 20365-2006，該法中針對鹽酸氨基葡萄糖采用HPLC法，選用C18柱為分離柱，192 nm為檢測波長。由于該化合物的極性較大，在C18柱上很難保留，在2.5 min內(nèi)即出峰。過早的出峰，除了與溶劑峰保留時間接近外，和樣品中雜質(zhì)峰難以分開，干擾過大。此外，195 nm為紫外檢測器的末端吸收，在該波長下檢測對流動相試劑要求很高，檢測時流動相對結(jié)果影響很大。本法利用該化合物的電導(dǎo)性，選用陰離子色譜柱作為分離柱，用電導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測。該法靈敏度高，鹽酸氨基葡萄糖最低檢測質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1,維生素C質(zhì)量濃度為0.2 μg·mL-1,準(zhǔn)確度和重復(fù)性均良好，可為國家制定葡維氨糖膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的檢測標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持和參考依據(jù)。

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