陳 昭 龔晨雨 邵紅偉 張文峰

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣州 510006)

近年來，腫瘤的免疫治療取得了巨大進展，其旨在激活人體免疫系統(tǒng)，希望依靠自身免疫機能殺滅癌細胞和腫瘤組織[1]。過繼性免疫細胞治療(Adoptive cellular therapy,ACT)屬于腫瘤免疫治療的重要組成部分，其通過向患者回輸在體外擴增的自身或同種(特異性或非特異性)免疫細胞，從而達到抗腫瘤目的[2]。

1 腫瘤的TCR-T細胞治療

T細胞受體(T cell receptor，TCR)是T細胞表面的一種受體分子，它特異性識別抗原提呈細胞上的抗原肽-MHC復(fù)合物，進而觸發(fā)T細胞免疫應(yīng)答。由于TCR分子決定著T細胞的抗原識別特異性，如果將腫瘤抗原特異性的TCR基因轉(zhuǎn)入普通T細胞中，能夠賦予該T細胞腫瘤抗原的識別能力，經(jīng)體外活化增殖后再轉(zhuǎn)輸入患者體內(nèi)，可以發(fā)揮抗腫瘤功效[3]。因此利用TCR基因?qū)氲姆椒梢苑奖愕孬@得大量識別特定抗原的T細胞，經(jīng)TCR基因修飾的T細胞被稱為TCR-T，近年來TCR-T已經(jīng)成為腫瘤免疫治療中的研究熱點，在臨床實驗中顯示了良好的治療效果。

利用TCR基因修飾T細胞的研究興起于上世紀90年代末，其大致發(fā)展歷程如圖1所示。1999年，Clay等[4]首先在黑色素瘤模型上進行了相關(guān)的研究，表明利用外源TCR基因改造T細胞用于腫瘤的過繼性移植治療是可行的。2001年，Kessels等[5]通過腫瘤抗原識別的TCR基因修飾T細胞后回輸小鼠體內(nèi)，觀察到明顯的腫瘤消退，同時并未出現(xiàn)明顯的自身免疫反應(yīng)。2006年，Rosenberg等領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊在《科學(xué)》雜志發(fā)表了他們在黑色素瘤患者中進行的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果[6]，在對17例患者進行TCR-T細胞過繼性回輸治療之后，有2例患者的瘤體發(fā)生了明顯消退，有15例患者體內(nèi)TCR-T細胞的比例在2個月后仍達10%以上，這是關(guān)于TCR-T療法的首次臨床試驗。2009年，Johnson等[7]針對黑色素瘤患者進行了第二次臨床試驗，分離自患者的外周血T細胞經(jīng)特異性識別黑色素瘤抗原MART-1的TCR基因修飾并回輸后，響應(yīng)率達到了30%，并且較第一次臨床試驗，此次T細胞表面TCR分子的表達強度及回輸后TCR-T細胞的體內(nèi)存活時間明顯增加。

嵌合抗原受體修飾的T細胞治療(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)和TCR-T細胞治療是當前過繼性細胞治療中兩種重要的治療方法。與傳統(tǒng)的CIK和DC-CIK細胞治療相比，CAR-T 和TCR-T細胞治療都具有腫瘤識別特異性，屬精準免疫細胞治療范疇。與CAR-T相比，TCR-T可以借助于MHC分子的提呈從而識別胞內(nèi)抗原，識別的靶點范圍更廣，信號活化受到較為嚴密的調(diào)控，不易誘發(fā)細胞因子風暴，具有良好的開發(fā)前景與應(yīng)用價值[8,9]。

2 腫瘤特異性TCR 基因的篩選

TCR 分子主要由α和β兩條鏈組成，其編碼基因V,(D)J,C 在T 細胞發(fā)育過程中經(jīng)過胚系重排，在胸腺中經(jīng)過陽性選擇和陰性選擇過程，成為具有MHC識別限制性。機體成熟T細胞所產(chǎn)生的TCRαβ組成了一個能與成千萬種抗原結(jié)合的抗原識別受體庫(Repertoire)，從理論上估計，TCRαβ受體庫的容量在1015以上[10]。成功獲得腫瘤抗原特異性的TCR基因是腫瘤TCR-T細胞治療的重要前提，目前腫瘤特異性TCR基因的篩選主要通過獲得腫瘤抗原特異性識別的T細胞，然后克隆其TCR基因。

2.1基于多細胞RT-PCR的擴增技術(shù) MHC-肽五聚體(Pentamer)流式細胞技術(shù)是一種簡便、靈敏的抗原表位特異性檢測方法[11]，熒光標記的MHC-肽五聚體與T細胞孵育后，特異性識別MHC-肽五聚體的T細胞即可被激發(fā)熒光并通過流式分選，因此可以用來分離抗原特異性的單個T細胞克隆。大致流程為從腫瘤患者外周血分離出單核細胞，其中貼壁細胞利用集落刺激因子和IL-4刺激后，得到樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)，然后將合成的腫瘤抗原肽與其孵育獲得負載抗原的成熟DC；上述非貼壁的T細胞經(jīng)負載抗原DC多次刺激，誘導(dǎo)細胞毒性的T淋巴細胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)；根據(jù)腫瘤患者的HLA類型，制備出相應(yīng)的腫瘤抗原肽-MHC五聚體，然后利用流式細胞技術(shù)篩選出單個特異性的CTL。最后通過體外擴增單個特異性CTL獲得一定數(shù)量的T細胞，然后通過RT-PCR擴增獲得其特異性TCR基因。

特異性識別腫瘤抗原的單個T細胞，在體外增殖的周期較長且條件較為嚴格(需要鈷60照射的滋養(yǎng)層細胞)，因此不易獲得足夠數(shù)量的細胞用來進行PCR擴增，目前只有少數(shù)實驗室成功通過此法獲得腫瘤特異性的TCR基因。

2.2利用單細胞RT-PCR擴增技術(shù) 目前基于單細胞RT-PCR擴增技術(shù)取得了極大進展且日趨成熟，因此分離得到腫瘤抗原特異性T細胞單克隆后，針對該單細胞克隆進行反轉(zhuǎn)錄，并通過PCR克隆其TCR基因，該方法避免了單個T細胞克隆復(fù)雜繁瑣的體外增殖培養(yǎng)過程。根據(jù)PCR過程中使用引物的不同，又可以分為基于5′RACE擴增和基于多重引物的PCR擴增兩種方法。

2.2.1基于5′RACE擴增 根據(jù)序列的同源性，人Vα可分為32個亞家族，人Vβ可分為24個亞家族[12]。分離得到的特異性T細胞單克隆的TCR基因，雖然其Vα和Vβ屬于哪個亞家族是未知的，但是可以通過基于5′RACE的PCR擴增，利用通用引物將其擴增得到，其流程如圖2 所示。該方法利用Oligo dT為引物，將所有mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，并利用反轉(zhuǎn)錄酶的特性在cDNA鏈的3′端加入一段寡核苷酸序列，然后利用長通用引物(其含有與寡核苷酸序列互補的序列，其余序列為短通用引物)與TCR基因C區(qū)特異性引物進行前兩輪PCR擴增，最后利用短通用引物和特異性引物完成剩下PCR反應(yīng)，通過此法可得到腫瘤抗原特異性識別的TCRα和TCRβ基因。Rosenberg團隊利用該方法成功篩選到針對黑色素瘤相關(guān)抗原MART-1的高親和力TCR基因[13]。Kobayashi等[14]研究者基于該方法，從腫瘤患者外周血中成功篩選得到210個腫瘤抗原反應(yīng)性的TCR分子，從反應(yīng)性TCR分子的獲得到TCR分子識別腫瘤抗原肽的驗證，整個過程只需要10 d即可完成。2017年，Parkhurst等[15]利用腫瘤相關(guān)抗原的突變肽從腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)中分離到反應(yīng)性CD8+CD137+細胞，利用單細胞5′RACE從6個患者中成功分離到27個TCR分子，為從TIL中分離特異性TCR分子提供了良好借鑒。但是該方法對操作者的實驗水平要求較高，并且依賴于價錢不菲的試劑盒。

圖1 TCR基因治療的大致發(fā)展歷程[3]Fig.1 Milestones in development of TCR gene therapy[3]

2.2.2基于多重引物的PCR擴增 Kim等[16]對基于多重PCR擴增的方法進行了探索，大致流程如圖3所示。其通過設(shè)計9條簡并引物覆蓋Vβ的24個亞家族序列，24條引物覆蓋Vα的32個亞家族序列。因此利用TCRα和TCRβ的C區(qū)特異性引物完成反轉(zhuǎn)錄步驟后，分別利用24條Vα引物、9條Vβ引物和C區(qū)引物進行PCR擴增；將上述PCR產(chǎn)物作為模板，繼續(xù)進行α鏈和β鏈的擴增；其中β鏈擴增采用錨定PCR的方法，利用上述9條簡并引物(5′端均含有22個堿基的通用序列)進行延伸反應(yīng)，獲得5′端帶有通用序列的DNA并作為模板，利用通用引物和C區(qū)引物繼續(xù)進行PCR擴增，然后通過測序獲得TCRβ基因。α鏈的擴增采用巢式PCR的方法，將上述24條Vα引物分為5管，分別和C區(qū)引物進行PCR擴增，從而獲得TCRα基因。2016年，Hamana等[17]進一步創(chuàng)新將PCR與5′RACE結(jié)合，在分離到單個反應(yīng)性T細胞后，首先進行5′RACE擴增，然后進行PCR，最后通過Gibson組裝方法獲得攜帶特異性TCR分子的表達盒進行功能驗證，建立了一個從篩選到功能驗證的簡單、有效系統(tǒng)。

圖2 基于單細胞5′RACE的PCR擴增流程圖Fig.2 Strategy to identify paired TCR α- and β-chains based on 5′-RACE reactions from single T cells

成功分離單個T細胞是利用單細胞RT-PCR擴增TCR基因過程中的關(guān)鍵步驟之一。常規(guī)分離單個細胞方法有激光顯微切割技術(shù)、顯微操作、流式細胞術(shù)及有限稀釋法等。激光顯微切割技術(shù)、流式細胞儀和顯微操作雖然能夠保證分離到單個細胞，但需要較為昂貴復(fù)雜的儀器，有限稀釋法難以保證精確分離單細胞。為了摸索簡單、有效、經(jīng)濟的單細胞分離操作方法，我們利用自制毛細玻璃吸管挑取單個T細胞。該方法所需器材十分簡單，在倒置顯微鏡下，操作者利用嘴的吹吸能力控制毛細玻璃吸管將細胞轉(zhuǎn)移到含有 RNA 酶抑制劑的 PCR 管中，并進行后續(xù)單細胞反轉(zhuǎn)錄過程。

2.3基于CDR3片段長度多態(tài)性分析篩選TCR基因 TCR基因的重排為一隨機過程，不同T細胞經(jīng)過基因重排，可表達不同特異性的TCR，在克隆水平每個T細胞識別各自特異性的抗原，在個體水平則呈現(xiàn)豐富的多樣性。TCR的多樣性由α鏈和β鏈的V區(qū)決定，Vα和Vβ各有三個互補決定區(qū)(Complementarity determining region,CDR)，CDR1、CDR2僅由V基因片段編碼，只有CDR3直接和抗原相互作用，TCR的多樣性主要由CDR3決定[18]。

圖3 基于單細胞的多重PCR擴增流程圖[16]Fig.3 Strategy to identify paired TCR α-and β-chains based on multiplex PCR from single T cells[16]

設(shè)計針對每個亞家族的引物并進行RT-PCR擴增，然后利用免疫掃描譜型分析技術(shù)可得出每個亞家族的CDR3譜型情況[19,20]。正常情況下，健康人外周血TCR基因CDR3長度具有多樣性，每個Vα亞家族和每個Vβ亞家族均呈多峰譜型的高斯分布[21]。當TCR分子與抗原特異性識別后，特異性識別的T細胞克隆迅速增殖，此時Vα和Vβ某些特定亞家族可能出現(xiàn)單峰譜系，利用該特定亞家族特異性引物進行RT-PCR擴增可獲得該單峰譜系Vα和Vβ亞家族的CDR3區(qū)序列，結(jié)合該亞家族CDR1和CDR2序列便可獲得特異性的全長TCR基因序列。

本實驗室基于TCR基因CDR3片段長度多態(tài)性分析，從健康人外周血中成功篩選到識別腫瘤相關(guān)抗原Survivin點突變抗原肽的特異性TCRVα4和TCRVβ7基因，并驗證了其對抗原肽的特異性識別作用，以及該特異性TCR基因修飾T細胞的腫瘤殺傷功能[22]。需要指出的是，經(jīng)腫瘤抗原肽刺激后Vα和Vβ的某些亞家族能夠出現(xiàn)單峰譜系，是利用此方法篩選腫瘤特異性TCR基因的一個前提條件。因此，該方法在具體實施中會受到一些限制。

3 存在問題及展望

高親和力腫瘤特異性TCR 基因的獲得是TCR-T細胞治療的前提。由于大部分腫瘤抗原均為自身抗原，外周T細胞經(jīng)歷了陰性選擇，其TCR分子對自身抗原肽/MHC復(fù)合物的親和力低下，難以有效活化和形成克隆，表現(xiàn)為一種無反應(yīng)性狀態(tài)[23,24]。因此從外周血中獲得反應(yīng)性T細胞克隆的難度極大，也就難以獲得高親和力的腫瘤特異性TCR基因。為了解決該難題，Blankenstein團隊構(gòu)建了一個特別的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其擁有人TCR基因座位(小鼠的TCR基因已被破壞)以及人的MHC基因；利用腫瘤抗原免疫該轉(zhuǎn)基因小鼠，可以用來篩選針對腫瘤抗原高親和力的TCR基因[25]。但是構(gòu)建如此的轉(zhuǎn)基因小鼠并非易事，難以推廣。

近年來，腫瘤基因組高通量測序結(jié)果顯示，腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中會發(fā)生大量的突變，發(fā)生在編碼區(qū)的非同義突變會造成蛋白序列的改變，從而導(dǎo)致腫瘤細胞表達出在正常細胞中不存在的突變蛋白，這些突變蛋白在細胞內(nèi)被降解成短肽，被MHC分子提呈在細胞表面，作為外源抗原被T細胞的TCR分子所識別，導(dǎo)致T細胞活化，進而攻擊清除腫瘤細胞。由非同義突變所導(dǎo)致的異常蛋白被稱為新抗原，屬于腫瘤特異性抗原。由于是新抗原，因此人體內(nèi)存在識別他們的高親和力TCR，并且新抗原在正常細胞內(nèi)不存在，因此以其為治療靶點不太可能引起自身免疫毒性[26]。

隨著高通量測序的普及以及腫瘤基因組項目和腫瘤基因組圖譜計劃等的實施，腫瘤的突變信息被越來越多地揭示出來，同時表位預(yù)測工具日益成熟可靠，這為尋找腫瘤新抗原提供了便捷的資源和有力的工具。另外，隨著在TCR基因結(jié)構(gòu)域改造、減少雜合TCR分子產(chǎn)生等方面的研究日益深入，TCR-T的抗腫瘤效果不斷提高，這些都為深入開展靶向新抗原的TCR-T研究奠定了良好的基礎(chǔ)，勢必會更好地促進抗腫瘤免疫治療的發(fā)展。

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