管章春 劉方杰 劉成華 高亞萍 沈倍奮 楊 光

(廣西醫(yī)科大學(xué),南寧 530000)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又稱綠膿桿菌，是自然界廣泛存在的革蘭氏陰性致病菌，也是院內(nèi)感染最主要的病原體之一。其能引起各類(lèi)急慢性感染，是囊性纖維化患者致死的重要原因。另外，PA常常在機(jī)械性氣道損傷、免疫抑制或患有艾滋病、腫瘤的患者體內(nèi)引發(fā)急性肺炎[1-5]。目前臨床上主要采用抗生素治療PA引起的各種感染。然而隨著抗生素的廣泛使用，PA耐藥菌株被分離的報(bào)道不斷增加[6]，開(kāi)發(fā)基于針對(duì)PA感染新的抗感染策略極為重要?？贵w藥物可以通過(guò)中和毒素、吞噬調(diào)理作用等消除病原體，并且抗體具有特異性高、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在抗感染領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。

PA的致病機(jī)制包括細(xì)菌表面的毒力因子和細(xì)菌的外分泌毒素。其分泌毒素主要是經(jīng)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌[7]。PcrV蛋白為Ⅲ型分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，通過(guò)將細(xì)菌產(chǎn)生的毒力蛋白分子直接輸送到宿主細(xì)胞內(nèi)，干擾宿主細(xì)胞的正常功能，引發(fā)宿主細(xì)胞的死亡。基因突變研究證實(shí)，PcrV缺失后，細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)不能與宿主細(xì)胞膜結(jié)合，從而不能夠損傷宿主細(xì)胞[8，9]。目前，PcrV已經(jīng)成為新的抗銅綠假單胞菌感染的藥物研發(fā)靶點(diǎn)。

本研究從PA菌株P(guān)AO1基因組中調(diào)取PcrV基因，并構(gòu)建其重組表達(dá)載體，成功獲得了PcrV蛋白。利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選出抗PcrV蛋白的全人源單克隆抗體YG5，小鼠肺炎模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明YG5能夠明顯抑制PA對(duì)機(jī)體的感染，具有很好的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 PA菌株P(guān)AO1(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所藍(lán)樂(lè)夫教授贈(zèng)送)，原核表達(dá)載體pET-28a、全人源naive Fab抗體庫(kù)、M13KO7(本室保存)；無(wú)特定病原體級(jí)BALB/c純系雌性小鼠，鼠齡8周(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)、HiFiTaq聚合酶、dNTP(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物技術(shù)公司)；限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ(TaKaRa公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、T4 DNA 連接酶、Trans2K DNA標(biāo)志物、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(北京全式金生物科技公司)；anti-M13抗體(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)；PEG8000(Sigma)；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2PCR引物設(shè)計(jì) 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PcrV正向引物5′-GAC-TGCTAGCATGGAAGTCAGAAACCTTAATG-3′反向引物5′-AGTCGAATTCCTAGATCGCGCTGAGAATGTC-GCG-3′，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pET-28a-PcrV重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以PAO1菌株基因組為模板，利用PcrV基因特異性上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件如下：94℃、5 min；94℃、30 s；55℃、30 s；72℃、90 s；30個(gè)循環(huán)，72℃，10 min；擴(kuò)增片段大小為885 bp。將 PCR擴(kuò)增得到的PcrV基因片段，利用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ酶切，回收目的片段亞克隆至pET-28a載體，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR和提取質(zhì)粒酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，并進(jìn)一步送交測(cè)序鑒定。

1.2.2PcrV蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及純化 使用LB(Kana+)培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)測(cè)序正確陽(yáng)性單克隆菌落，次日按照1∶100轉(zhuǎn)接至新鮮LB(Kana+)培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.7，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，繼續(xù)室溫培養(yǎng)6 h 后，4℃，8 000 r/min離心15 min收集菌體。使用結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Na3PO4，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH7.4)重懸菌體，超聲破碎(每次10 s，間隔10 s，共30 min)后，4℃，12 000 r/min離心15 min分別收集沉淀和上清，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后將超聲所獲上清與Ni2+螯和樹(shù)脂孵育，利用含20 mmol/L咪唑的洗滌液洗滌Ni2+柱，最后用含500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白，利用BCA法定量所獲目的蛋白濃度并利用SDS-PAGE檢測(cè)其純度。

1.2.3噬菌體抗體庫(kù)的制備 取30 μl naive Fab抗體庫(kù)甘油菌接種到50 ml 的2YTAG培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞密度OD600=0.1左右。37℃、220 r/min，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8之間。向50 ml培養(yǎng)液中加入100 μl的M13KO7，37℃靜置30 min。4 000 r/min，25℃，離心15 min。棄上清，將沉淀重懸至250 ml 2YTAK培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌7 000 r/min，4℃，離心15 min；上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，并加入1/4體積的PEG/NaCl沉淀噬菌體，冰浴1 h。7 000 r/min，4℃，離心15 min，棄上清。噬菌體沉淀重懸于20 ml PBS中。10 000 r/min，4℃，再次離心15 min，除去殘留的細(xì)胞碎片。上清移入新的50 ml離心管中，加入1/4體積的上述PEG/NaCl溶液，冰浴20 min。7 000 r/min，4℃，離心15 min，棄上清。噬菌體沉淀重懸于5 ml 含20%甘油的PBS中，即得到純凈的噬菌體懸液。取10 μl噬菌體懸液重新感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.2.4噬菌體抗體庫(kù)的親和淘選 用無(wú)菌PBS稀釋抗原PcrV至終濃度為10 μg/ml，吸取500 μl溶液包被免疫管，4℃過(guò)夜。同時(shí)設(shè)置只包被PBS的陰性對(duì)照。無(wú)菌PBS洗滌免疫管3次，之后用4%的脫脂奶粉/PBST室溫封閉1 h。同時(shí)用4%的脫脂奶粉封閉噬菌體抗體庫(kù)，室溫1 h。無(wú)菌PBS洗滌免疫管3次，將封閉好的抗體庫(kù)加入到免疫管中，每管500 μl，噬菌體的投入量約為1.2×1012，室溫靜置1 h。PBST洗滌15次，PBS洗滌15次，3 min/次。每管加入500 μl Glycine-HCl(0.1 mol/L，pH2.2)洗脫噬菌體，室溫放置10 min。倒出洗脫液，迅速用1.5 mol/L的Tris-HCL(pH8.8)中和至pH7.4。將500 μl的上述洗脫液感染10 ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1菌液，37℃靜置30 min。取200 μl、100 μl等不同體積的菌液分別涂布于2YTAG固體平板上，用于計(jì)算產(chǎn)量和挑取單克隆。剩下的菌液4 000 r/min，離心15 min后，棄去上清，將菌體涂布于2YTAG固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，為第二輪篩選做準(zhǔn)備。觀察克隆生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。將菌落從2YTAG平板上刮下，重懸于含20%甘油的2YTAG培養(yǎng)基中，凍存于-70℃。按如上步驟進(jìn)行第二輪和第三輪親和淘選。

1.2.5ELISA實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆 挑取經(jīng)過(guò)三輪篩選后獲得的單克隆菌落，接種于1 ml 2YTAG培養(yǎng)基中(采用96孔深孔板)，37℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。分別吸取30 μl的過(guò)夜菌接種于900 μl的2YTAG培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，每孔加入5×1010的輔助噬菌體M13KO7，37℃靜止感染30 min。1 800 r/min，4℃離心15 min，棄去上清，用1 ml 2YTAK重懸沉淀，28℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。收取噬菌體上清，利用ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆送交測(cè)序。

1.2.6pIgH和pIgL重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，利用抗體重鏈和輕鏈特異性上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件如下：94℃、5 min；94℃、30 s；60℃、30 s；72℃、30 s；30個(gè)循環(huán)，72℃、10 min；擴(kuò)增片段大小為360 bp和321 bp。將 PCR擴(kuò)增得到的VH和VL基因片段，利用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SalⅠ酶切，回收目的片段亞克隆至pIgH和pIgL載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR和提取質(zhì)粒酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆(分別命名為pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL)，并進(jìn)一步送交測(cè)序鑒定。

1.2.7Anti-PcrV抗體YG5的表達(dá)及純化 將測(cè)序正確的陽(yáng)性單克隆pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL分別接種至100 ml 2YTA培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。8 000 r/min，4℃，離心15 min收菌。然后采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL質(zhì)粒備用；75 μg質(zhì)粒(pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL比例為1∶1)重懸于2.5 ml FreeStyle F17細(xì)胞培養(yǎng)基中，225 μg轉(zhuǎn)染試劑PEI也重懸在2.5 ml FreeStyle F17細(xì)胞培養(yǎng)基中；將PEI緩慢的加入到質(zhì)粒中，充分混合，室溫放置約15 min；將上述混合液加入到45 ml 293E細(xì)胞中(細(xì)胞密度為1×106ml-1)，37℃細(xì)胞搖床培養(yǎng)7 d。3 000 r/min，離心15 min收取培養(yǎng)細(xì)胞上清。采用裝有Protein A填料的樹(shù)脂親和純化抗體。使用0.2 mol/L pH2.2的Glycine-HCl洗脫抗體，然后使用1.5 mol/L的Tris-HCL(pH9.1)將洗脫液中和至pH7.4。將純化后抗體超濾濃縮，使用PBS(pH7.4)重懸后利用SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度。

1.2.8ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)全人源抗體YG5親和力 使用包被液稀釋PcrV至終濃度10 μg/ml，加入至ELISA板孔中，4℃包被過(guò)夜。PBST洗滌后，使用4%脫脂奶粉封閉，37℃、1 h。PBST洗滌5次，200 μl/孔，2 min/次。將樣品加入ELISA板孔中，100 μl/孔，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，200 μl/孔，2 min/次。將HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG按1∶40 000稀釋于4%奶粉中，100 μl/孔，37℃孵育1 h。TMB顯色液顯色，100 μl/孔，室溫顯色2～5 min。用2% H2SO4終止顯色，50 μl/孔。讀取450 nm吸光值，使用GraphPad 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.9急性肺炎模型驗(yàn)證YG5抗體活性 將雌性BALB/c 小鼠21只隨機(jī)分為3組，每組7只。分別腹腔注射0.5 mg/ml的抗體、對(duì)照抗體或無(wú)菌PBS 200 μl。其中，對(duì)照抗體為抗金黃色葡萄球菌外分泌蛋白的全人源單克隆抗體。4 h后使用1%戊巴比妥納麻醉小鼠后固定于專用手術(shù)臺(tái)，75%乙醇消毒后自頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離直至暴露氣管，用 1 ml注射器將銅綠假單胞菌(1×106CFU)懸液經(jīng)氣管緩慢注入兩肺。觀察記錄小鼠48 h內(nèi)的死亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 Graph Pad Prism 5.0 軟件進(jìn)行作圖，Log-rank(Mantel-Cox)Test分析不同數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1PcrV重組蛋白的表達(dá)

2.1.1表達(dá)載體pET-28a-PcrV的構(gòu)建 以PAO1基因組DNA為模板，利用PcrV基因上下游特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，擴(kuò)增得到約885 bp大小的單一條帶(圖1A)，使用NheⅠ和EcoRⅠ酶切獲得PcrV基因片段，再克隆至表達(dá)載體pET-28a。菌落PCR鑒定結(jié)果顯示成功構(gòu)建pET-28a-PcrV重組表達(dá)載體(圖1B)。

2.1.2PcrV蛋白的表達(dá)和純化 挑取測(cè)序正確的陽(yáng)性菌落，IPTG誘導(dǎo)后收集菌體并超聲處理分別收取超聲上清及沉淀，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量30 kD處檢測(cè)到目的條帶，且其以可溶性形式表達(dá)。進(jìn)一步利用Ni2+螯合樹(shù)脂純親和化獲得純度較高的目的蛋白PcrV(圖2)。

2.2特異性抗體YG5的表達(dá)

2.2.1與PcrV特異性結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆的篩選與鑒定 包被PcrV蛋白，利用naive Fab抗體庫(kù)篩選PcrV蛋白特異結(jié)合噬菌體克隆。經(jīng)過(guò)三輪篩選，與PcrV結(jié)合的噬菌體克隆得到明顯富集。將第三輪篩選后洗脫的噬菌體感染TG1，從中隨機(jī)挑取84個(gè)克隆，加入輔助噬菌體，獲得展示單一Fab的噬菌體克隆(phage-Ab)，利用ELISA檢測(cè)phage-Ab與PcrV結(jié)合能力。圖3所示，根據(jù)吸光值(OD450 nm)不同，我們將挑選的克隆分為2組(OD450 nm<1∶23個(gè)克隆和OD450 nm≥1∶61個(gè)克隆)，挑選陽(yáng)性克隆(OD450 nm≥1)進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有克隆中的質(zhì)粒所編碼的抗體可變區(qū)序列完全相同，我們將該抗體命名為YG5。

圖1 表達(dá)載體pET-28a-PcrV的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector pET-28a-PcrVNote: A.PCR amplification of PcrV gene;B.Identification of recombinant vector of pET-28a-PcrV；M.Trans2K DNA marker.

圖2 PcrV蛋白的表達(dá)和純化Fig.2 Expression and purification of PcrV proteinNote: M.Protein marker;1.Whole bacteria cleavage products;2.Whole bacteria cleavage supernatant;3.Whole bacteria cleavage precipitation;4.Purification of PcrV protein.

2.2.2pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL重組質(zhì)粒的構(gòu)建 我們以包含YG5重鏈和輕鏈可變區(qū)(YG5VH和YG5VL)的質(zhì)粒為模板，利用抗體重鏈和輕鏈上下游特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，擴(kuò)增得到約360 bp和321 bp的條帶(圖4)。利用NheⅠ和SalⅠ酶切YG5VH和YG5VL片段，克隆至表達(dá)載體pIgH和pIgL。經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定，重組表達(dá)載體(pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL)構(gòu)建成功。

2.2.3特異性抗體YG5的表達(dá)及純化 我們將培養(yǎng)測(cè)序正確的pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL陽(yáng)性克隆細(xì)菌，提取pIgH-YG5VH和pIgL-YG5VL質(zhì)粒，并共轉(zhuǎn)染至293E細(xì)胞。使用ProteinA樹(shù)脂從細(xì)胞培養(yǎng)上清親和純化YG5抗體，并通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體純度。結(jié)果顯示，在還原條件下，在相對(duì)分子量約55和25 kD處可檢測(cè)到目的條帶，在非還原電泳條件下，在相對(duì)分子量約150 kD處可檢測(cè)到目的條帶(圖5)。

圖3 ELISA檢測(cè)陽(yáng)性克隆Fig.3 Detection of positive clones by ELISA

圖4 YG5抗體VH和VL片段的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of VH and VL fragments of YG5 antibodiesNote: M.Trans2K DNA marker;1.VL fragments of YG5 antibodies;2.VH fragments of YG5 antibodies.

2.2.4利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YG5抗體與PcrV蛋白親和力 我們將純化后的YG5抗體稀釋至不同的濃度，利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其與PcrV蛋白結(jié)合能力。采用GraphPad軟件做圖并分析數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，YG5與PcrV結(jié)合的EC50值為61 ng/ml(圖6)。

圖5 YG5 SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of YG5Note: M.Protein marker;1.Reduced SDS-PAGE analysis;2.Non-reducing SDS analysis

圖6 ELISA檢測(cè)YG5親和力Fig.6 Detection of YG5 affinity by ELISA

圖7 小鼠生存曲線Fig.7 Survival rate of MouseNote: The control antibody is an antibody against Staphylococcus aureus exocrine protein.*.P<0.05;**.P<0.01.

2.3急性肺炎模型驗(yàn)證YG5抗體抗感染活性 由于銅綠假單胞菌是誘發(fā)肺部感染的主要致病菌之一，我們?cè)陔S后的研究中，通過(guò)氣管插管注入細(xì)菌的方式建立了小鼠肺部感染銅綠假單胞菌的致死性模型，并在此基礎(chǔ)上檢測(cè)YG5抗體是否能夠抑制銅綠假單胞菌的感染，提高小鼠的存活率。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照抗體和PBS組相比，YG5能有效抑制銅綠假單胞菌的感染，降低小鼠的死亡率(圖7)。

3 討論

本研究成功構(gòu)建了pET-28a-PcrV重組表達(dá)載體，表達(dá)并純化銅綠假單胞菌重組蛋白PcrV。利用噬菌體抗體庫(kù)篩選出具有較高親和力的抗PcrV單克隆人源抗體YG5。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，YG5抗體能有效保護(hù)小鼠抵御銅綠假單胞菌的感染。

目前已知銅綠假單胞菌能夠感染宿主細(xì)胞導(dǎo)致疾病的主要原因是其能夠通過(guò) Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)的作用，逃避宿主巨噬細(xì)胞的吞噬降解 。T3SS蛋白按功能可分為分泌裝置、轉(zhuǎn)位器裝置、毒素蛋白和分子伴侶四部分。分泌裝置錨定在細(xì)菌胞膜上，通過(guò)針管狀結(jié)構(gòu)連接轉(zhuǎn)位器裝置，轉(zhuǎn)位器裝置被激活后，插入宿主細(xì)胞膜，形成轉(zhuǎn)位孔道，向宿主細(xì)胞輸入毒素蛋白，殺傷靶細(xì)胞[10]。PcrV 蛋白是形成轉(zhuǎn)位孔道的必需條件，是T3SS至關(guān)重要的組成部分，已成為免疫治療的重要靶點(diǎn)[11]。

針對(duì)微生物感染性疾病，治療性抗體相關(guān)藥物的研發(fā)取得了很大的進(jìn)展。目前已經(jīng)有4個(gè)用于治療感染性疾病的單抗藥物被FDA批準(zhǔn)上市，分別是抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)的Palivizumab單抗(Synagis)、抗炭疽桿菌的Raxibacumab單抗(ABthrax)和Obiltoxaximab單抗(Anthim)以及抗艱難梭菌感染的Bezlotoxumab單抗(Zinplava)[12]。除了以上幾種抗體藥物外，還有很多抗感染類(lèi)的抗體藥物正處于臨床研究階段或臨床前研究階段。隨著病原微生物誘發(fā)感染的機(jī)制深入研究，會(huì)發(fā)現(xiàn)和鑒定一系列參與微生物致病的功能分子，這將為治療性抗體研發(fā)提供更多的藥物靶點(diǎn)。

目前針對(duì)銅綠假單胞菌感染的在研抗體主要有4種，分別是 MEDI3902、Panobacumab、KB001和AerucinTM[13-15]。其中，MEDI3902和AerucinTM已經(jīng)完成Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)，Panobacumab和KB001已經(jīng)完成Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)。全人源單克隆抗體YG5是不同于以上抗體的新抗體，能夠顯著抑制銅綠假單胞菌對(duì)機(jī)體的感染，有可能成為新的抗銅綠假單胞菌感染的治療性藥物。

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