王俊鋼 李聰聰 毛廣顯 張 潔 楊 翠

(鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院/南陽市中心醫(yī)院胸外科，南陽 473000)

肺癌是全世界最主要的癌癥相關(guān)死亡原因之一，發(fā)病率持續(xù)上升[1]。非小細(xì)胞肺癌是除小細(xì)胞肺癌以外的其他上皮來源的肺癌[2]。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的85%[3]。肺癌的治療和長(zhǎng)期療效取決于其類型、分期和患者的整體健康狀況。常見的治療手段包括手術(shù)、化療和放療[4]。與小細(xì)胞癌相比，非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療相對(duì)不敏感[5]。雖然許多治療方法已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用，但肺癌患者的長(zhǎng)期生存率卻不盡如人意[6]。隨著免疫治療和分子靶向治療的興起，需要進(jìn)一步提高我們對(duì)肺癌發(fā)生的分子生物過程的理解，尋找潛在的標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT-1)是一個(gè)7 kb 長(zhǎng)鏈非編碼RNA，屬于LncRNA的一種，定位于染色體11q13上，在哺乳動(dòng)物中高度保守并在細(xì)胞核中表達(dá)，能發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[7]。 MALAT-1與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，并且是肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[8]。

microRNA是一種短鏈的非編碼調(diào)節(jié)RNA，它已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[9]。microRNA有希望成為非小細(xì)胞肺癌新的生物標(biāo)志物[10]。有研究表明miR-205在多種腫瘤中起到抑癌的作用[11]。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-205參與了腫瘤的侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]，在鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)高于腺癌[13]。但是對(duì)于miR-205在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制卻不明確。

本研究中，我們?cè)u(píng)估了MALAT-1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)，并進(jìn)一步探討MALAT-1和miR-205的相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系和試劑 人非小細(xì)胞肺癌株A549、H1299、H460由上海細(xì)胞生物研究所提供。RPMI-1640培養(yǎng)液、10%新生小牛血清、含100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的0.25% 胰酶溶液購自Gibco公司,二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。細(xì)胞在含有10%FBS，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml 鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%左右濃度時(shí)進(jìn)行傳代和凍存，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。

1.2方法

1.2.1miRNA提取和qPCR試驗(yàn) 使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的總RNA，并使用賽默飛miRNATM分離試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)進(jìn)一步純化miRNA部分。通過光譜測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(qPCR)。U6管家基因作為對(duì)照。反應(yīng)條件：95℃10 min，45個(gè)循環(huán)；在95℃變性10 s，在60℃下退火和延伸60 s。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的miRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 通過慢病毒轉(zhuǎn)染獲得表達(dá)MALAT-1+siRNA和miR-205-inhibitor的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，將編碼MALAT-1+siRNA或空載體的慢病毒感染到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中。并根據(jù)制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞48 h，獲得相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.3雙熒光素酶試驗(yàn)測(cè)定 為了驗(yàn)證MALAT-1和miR-205的相關(guān)關(guān)系，我們使用雙熒光素酶測(cè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。首先我們構(gòu)建了miR-205攜帶3′-UTR的熒光素酶報(bào)告因子，其中每個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)與MALAT-1結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。熒光素酶測(cè)定顯示MALAT-1下游結(jié)合位點(diǎn)miR-2053′-UTR符合，而不是其他靶點(diǎn)基因，將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293U細(xì)胞中熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。根據(jù) siPORTneoFX使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)(Promega)，轉(zhuǎn)染24 h后測(cè)定熒光素酶活性。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染的螢火蟲熒光素酶活性被檢測(cè)為海腎熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。MALAT-1的引物序列：5′-CTATGCATGCATGCTAGCATCGAT-3′；3′-ATCGATCGTACGTACGACGTAC-GT-5′；miR-205克隆的引物如下：5′-TAGCTAGCAGTCGCATCGATCGTA-3′；3′-GTAGCTAGCTAGC-TAGCTAGCTAG-5′。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn) 將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549(48 h)進(jìn)行胰蛋白酶消化，并將適量細(xì)胞平鋪在6孔板上。使用200 μl無菌槍頭輕劃孔板，每個(gè)孔劃4～5次，盡量保證所劃線處于平行狀態(tài)，放置37℃恒溫細(xì)胞培育箱，在24 h后，分別用適量PBS沖洗孔板，顯微鏡下觀察SKVO3卵巢癌細(xì)胞遷移的距離。然后對(duì)比各組之間的統(tǒng)計(jì)差異。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 通過Transwell對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549侵襲能力測(cè)定。將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549在含有0.1%FBS的DMEM中培養(yǎng)。 24 h后，在沒有FBS或HGF的DMEM中的2×105個(gè)饑餓過的細(xì)胞用含有基質(zhì)膠的小室(直徑6.5 μm，孔徑為8 μm，Corning，NY，USA)接種在上室中，將具有10%FBS和HGF(20 ng/ml)的培養(yǎng)基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面上的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈后，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。三次獨(dú)立測(cè)定后取其平均值。

1.2.6裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 選擇BALB/c小鼠(18～20 g)10只，由動(dòng)物中心提供。小鼠喂養(yǎng)在25℃和70%相對(duì)濕度的環(huán)境下，同時(shí)給予12 h光照/黑暗循環(huán)。所有小鼠的飲水及飼料都經(jīng)過高溫高壓處理。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，分為對(duì)照組和MALAT-1-siRNA組。調(diào)整為細(xì)胞濃度為2×105ml-1。在無菌條件下，小鼠首先被固定，用酒精消毒右腋窩皮膚。然后用0.2 ml含有A549腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基接種在小鼠右腋窩，建立實(shí)體腫瘤模型。注射細(xì)胞后，監(jiān)控小鼠的存活率、體重和生存狀態(tài)。2周后通過頸椎脫位法處死荷瘤小鼠。測(cè)量死亡小鼠的腫瘤的尺寸、重量，并統(tǒng)計(jì)之間差異。

2 結(jié)果

2.1MALAT-1和miR-205在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況 我們首先通過qPCR檢測(cè)MALAT-1和miR-205在不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。MALAT-1在A549、H1299、H460細(xì)胞株中的表達(dá)如圖1A所示，在A549中的表達(dá)相對(duì)最高(1.40±0.12)，與H1299(0.91±0.08)、H460(0.75±0.11)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖1B所示，miR-205在A549細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于H1299和H460(P<0.05)。

2.2雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)MALAT-1和miR-205的關(guān)系 使用siRNA將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中的MALAT-1進(jìn)行下調(diào)，siRNA的轉(zhuǎn)染效率如圖2A所示。在siRNA轉(zhuǎn)染后，MALAT-1-siRNA組中MALAT-1的相對(duì)表達(dá)量明顯降低[(0.32±0.05)vs(1.03±0.25),P<0.05]。

圖1 MALAT-1和miR-205在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.1 Expression of MALAT-1 and miR-205 in different non-small cell lung cancer cell lines

為明確與MALAT-1相關(guān)的miRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具發(fā)現(xiàn)MALAT-1可能與miR-205有直接作用，兩者較為相似的結(jié)合序列(圖2B)。為了驗(yàn)證MALAT-1能否與miR-205 3′UTR相結(jié)合，我們將MALAT-1-siRNA與miR-205共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示(圖2C)：MALAT-1-siRNA可以明顯抑制miR-205的熒光素酶活性。結(jié)果表明，MALAT-1-siRNA能與miR-205的3′UTR特異性結(jié)合，并可以調(diào)控其表達(dá)活性與水平。

2.3MALAT-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，MALAT-1-siRNA組通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(52.52±3.24)，明顯少于對(duì)照組(77.34±2.79)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明抑制MALAT-1的表達(dá)可以減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力。

圖2 雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)MALAT-1和miR-205的關(guān)系Fig.2 Dual luciferase assay examines relationship between MALAT1 and miR-205

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MALAT-1對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的影響Fig.3 Transwell assay to detect effect of MALAT-1 on invasiveness of A549 cells

2.4MALAT-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549遷移的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，MALAT-1-siRNA組細(xì)胞的遷移速率明顯低于對(duì)照組，遷移率下降了約59%(P<0.05)，說明抑制MALAT-1的表達(dá)可以減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的遷移能力。

2.5miR-205對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549侵襲行為的影響 使用miR-205的抑制劑探討其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的侵襲力。如圖5所示，MALAT-1-siRNA+miR-205-inhibitor組通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(63.17±6.13)，明顯多于MALAT-1-siRNA組(36.23±7.36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力隨miR-205的降低而增強(qiáng)，miR-205可以抑制A549細(xì)胞的侵襲能力，說明抑制miR-205的表達(dá)可以促進(jìn)MALAT-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549侵襲能力的增強(qiáng)作用。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MALAT-1對(duì)A549細(xì)胞遷移力的影響Fig.4 Scratch test to detect effect of MALAT-1 on migration of A549 cells

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-205對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的影響Fig.5 Transwell assay to detect reversal effect of miR-205 on invasiveness of A549 cells

2.6miR-205對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549遷移行為的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，MALAT-1-siRNA+miR-205-inhibitor組細(xì)胞的遷移比率(0.98±0.12)明顯高于MALAT1-siRNA組(0.32±0.08)，后者遷移率下降了68%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的遷移能力隨miR-205的降低而增強(qiáng)，miR-205可以抑制A549細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明抑制miR-205的表達(dá)可以促進(jìn)MALAT-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549遷移能力的增強(qiáng)作用。綜上所述，抑制miR-205的表達(dá)可以進(jìn)一步促進(jìn)MALAT-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用，間接說明miR-205和MALAT-1之間有相互調(diào)控的關(guān)系。

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-205對(duì)A549細(xì)胞遷移力的影響Fig.6 Scratch test to detect reversal effect of miR-205 on A549 cell migration

圖7 MALAT1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 成瘤能力的影響Fig.7 Effect of MALAT1 on tumorigenicity of non-small cell lung cancer A549 cells

2.7MALAT-1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549成瘤能力的影響 對(duì)小鼠尸體解剖見右腋下腫瘤均有生長(zhǎng)，腫瘤質(zhì)地較硬，呈類圓形。兩組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況如圖7所示：與對(duì)照組小鼠腫瘤大小相比，MALAT-1-siRNA組的腫瘤體積明顯縮小[(3.02±0.51)cm3vs(1.21±0.32)cm3，P<0.05]，重量減輕[(4.23±0.45)g vs(1.98±0.35)g，P<0.05]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明抑制MALAT-1的表達(dá)后，可以有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。

3 討論

大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者在中晚期才被確診，總體5年生存率<15%[14,15]。 因此，我們迫切需要發(fā)現(xiàn)早期診斷和監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌的新策略。有研究指出，約98%的DNA轉(zhuǎn)錄為非編碼的RNA，包括短鏈非編碼RNA(NcRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)[16]。microRNA(miRNA)屬于短鏈非編碼RNA(約含有22個(gè)核苷酸)，存在于絕大多數(shù)植物、動(dòng)物和一些病毒中[17]。它在調(diào)控RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)中起重要作用[18]。大多數(shù)miRNA位于細(xì)胞內(nèi)，一些miRNA通常稱為循環(huán)miRNA或細(xì)胞外miRNA也已在細(xì)胞外環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)[19]。

LncRNA被定義為長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸單位的內(nèi)源性細(xì)胞RNA，具有許多分子生物學(xué)功能，例如調(diào)節(jié)選擇性剪接、染色質(zhì)重塑和RNA的代謝等[20-22]。盡管LncRNA在功能和結(jié)構(gòu)上較已知的內(nèi)源性小RNA(如microRNA)有明顯不同，但是在這些RNA之間仍存在一些聯(lián)系[23]。MALAT-1，也被稱為NEAT2，在多種類型的生理過程中起到重要的作用，例如基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控等[24]。許多證據(jù)表明MALAT-1與多種癌癥的病理過程密切相關(guān)。它能調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，還能通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄改變細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[25,26]。MALAT-1被認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移和生存預(yù)后的一種標(biāo)志物，特別是對(duì)于肺腺癌的早期階段[27]。在肺鱗狀細(xì)胞癌中，MALAT-1的高表達(dá)也與預(yù)后不良相關(guān)[28]。MALAT-1可能會(huì)影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體外生長(zhǎng)和集落形成[29]。將敲低MALAT-1后的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞注射入裸鼠后，顯著減緩了腫瘤的生長(zhǎng)[30]。在本研究中，通過siRNA將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中的MALAT-1進(jìn)行下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力有顯著的改變。從Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，侵襲細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組有顯著的下降[(52.52±3.24)vs(77.34±2.79)，P<0.05]，而劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MALAT-1-siRNA組細(xì)胞的遷移速率也明顯低于對(duì)照組。在小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)中，MALAT-1-siRNA組的腫瘤體積和腫瘤明顯小于對(duì)照組，說明MALAT-1在非小細(xì)胞肺癌中起促癌的作用。

miR-205涉及許多正?；虍惓５牟±砩磉^程，包括細(xì)胞再生、增殖和侵襲等。miR-205通過轉(zhuǎn)錄后靶向調(diào)控相應(yīng)的基因，進(jìn)而參與不同腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[31]。在乳腺癌中，腫瘤中miR-205的表達(dá)較正常乳腺組織相有所下降，而高表達(dá)miR-205的乳腺癌患者往往獲得更長(zhǎng)的生存期[32]。類似的結(jié)果在前列腺癌的患者中也得到了證實(shí)，miR-205通過抵抗上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和減少細(xì)胞遷移和侵襲力，來達(dá)到抑制腫瘤的目的[33]。本試驗(yàn)先從生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到MALAT-1和miR-205有相似的結(jié)合序列位點(diǎn)，二者可能有相互調(diào)控的關(guān)系，然后通過雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MALAT-1的確可以影響miR-205的熒光活性，說明二者確實(shí)存在相互調(diào)控的關(guān)系。敲減MALAT-1的表達(dá)后miR-205的表達(dá)及活性均上調(diào)，表明MALAT-1可以抑制miR-205的表達(dá)水平。當(dāng)我們使用miR-205-inhibitor轉(zhuǎn)染MALAT-1-siRNA的A549細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，MALAT-1-siRNA+miR-205-inhibitor組細(xì)胞的遷移力和侵襲力均得到了顯著的提高，說明MALAT-1的確可以靶向抑制miR-205的表達(dá)，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲行為，而抑制miR-205的表達(dá)后，一定程度上促進(jìn)了MALAT1對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲行為的增強(qiáng)作用。

綜上所述，MALAT-1可以調(diào)控miR-205的表達(dá)影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的侵襲和遷移能力，為理解非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的分子機(jī)制和探索新的潛在治療策略提供相應(yīng)理論幫助，它可能成為治療非小細(xì)胞肺癌新的靶點(diǎn)。

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