烏 蘭 鄭源強 陳 哲 賈宇臣 丁 楓 崔正榮 石艷春

(內蒙古醫(yī)科大學自治區(qū)分子生物學重點實驗室，呼和浩特 010058)

肺癌是患病率極高的腫瘤，其死亡率在所有腫瘤種類中的上升比率最大，是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一[1]。目前化療仍是治療肺癌的重要措施。吉西他濱為肺癌治療的一線藥物，但它親水性強，分子量小，血漿半衰期短僅17 min，常規(guī)化療時其在瘤體內難以達到有效的作用濃度，而提高化療藥物的劑量則易導致不良反應增加并產(chǎn)生耐藥。聚乙酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是無毒的生物降解性聚合物，該聚合物在體內生物相容性好，可用于藥物緩釋制劑載體。與傳統(tǒng)藥物劑型相比，納米顆粒具有藥物緩釋和定向釋放的優(yōu)勢，可明顯增加靶器官病灶部位的藥物濃度，提高藥物的生物利用度，減輕藥物對非靶向部位的毒性，減少全身不良反應的發(fā)生。本研究將GemC18-PLGA-NPs應用于LLC細胞并檢測其對細胞體外增殖抑制效應和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1納米顆粒和藥品 GemC18-PLGA-NPs、PLGA-NPs、GemC18由美國德州大學奧斯汀分校藥學院崔正榮教授實驗室制備[2，3]。GemC18-PLGA-NPs 納米粒徑為(212±20)nm，Zeta 電位(-42.4±12)mV，多分散指數(shù)<0.2。Gemcitabine HCl(GemHCl)購自Biotang公司。

1.1.2細胞株、主要試劑和儀器 小鼠肺癌細胞(LLC)購自中國科學院細胞庫，四甲基偶氮藍(MTT)購自Amresco公司，DMEM、FBS、雙抗溶液均為以色列BI公司產(chǎn)品，AnnexinV-FITC/Propidium Iodide(PI)凋亡檢測試劑盒購自BD公司，酶標儀為Molecular Devices SpectraMax i3，細胞培養(yǎng)箱為Thermo 371,流式細胞儀BD FACSCalibur。

1.2方法

1.2.1細胞體外生長抑制實驗

1.2.1.1共分為4組 GemC18-PLGA-NPs組、GemC18組、GemHCl組和PLGA-NPs組。

1.2.1.2設置6個藥物濃度(按所含Gemcitabine計算)：0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L。流式細胞術檢測的藥物濃度為0.1 μmol/L。

1.2.1.3觀察時間 MTT法給藥后，分別在24、48、72 h進行檢驗。流式細胞術在給藥后48、72 h進行檢驗。

1.2.1.4細胞培養(yǎng) 將細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中(含10%FBS，100 U/ml青霉素和鏈霉素)，置于含5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.2.2MTT法檢測給藥后各組IC50值和細胞存活率(SR) 細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，取混懸細胞液，以5×103/孔，按每孔180 μl接種于96孔板，每組藥物設置5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后給藥。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔于結束培養(yǎng)前加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，輕輕震蕩，10 min后在570 nm波長處用酶標儀檢測光密度(OD)值。細胞存活率SR=(給藥組OD值-無藥組OD值)/(對照組OD值-無藥組OD值)×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測不同給藥組對Lewis細胞的凋亡作用 細胞消化后，取混懸細胞液，以2×105/孔，每孔3 ml的濃度接種于6孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)板設置4個復孔。在接種6孔板之前，用培養(yǎng)液潤濕一下，以免加入細胞不均勻，每加兩個孔混勻一下。放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，待24 h后細胞貼壁給藥，用0.1 μmol/L的藥物處理細胞。給藥后繼續(xù)孵育48和72 h，收集細胞，進行檢測。取出6孔板，消化，離心棄上清。用預冷的PBS洗滌3次，重懸細胞，調整細胞濃度為1×106ml-1。加入100 μl Annexin Ⅴ Binding Buffer，混勻并重懸細胞，用10 μl AnnexinⅤ FITC和10 μl PI，輕輕混勻。25℃避光染色15 min，漩渦混勻。每管加入400 μl AnnexinⅤ Bingding Buffer，混懸后進行過濾，過濾后1 h內檢測。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，以百分率表示。

1.3統(tǒng)計學分析 采用Graphpad5.0計算軟件，計算IC50值及細胞存活率，進行統(tǒng)計，對組間差異采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1吉西他濱GemC18-PLGA-NPs對Lewis肺癌細胞體外增殖抑制作用 MTT法檢測各給藥組IC50值及細胞存活率(SR)，各組檢測結果見圖1，在24、48 h時GemC18-PLGA-NPs組的IC50值均高于GemHCl組(P<0.05)，GemC18-PLGA-NPs組與GemC18組在24、48 h的IC50值存在差異(P<0.05)，在72 h無組間差異。GemC18與Gem-HCl在24 h的IC50值存在差異(P<0.05)，在48、72 h無明顯差異(P>0.05)。

圖1 給藥24、48、72 h后各組藥物對LLC細胞的增殖抑制作用(IC50值)Fig.1 IC50 values of different groups after 24,48，72 hNote: *.P<0.05,compared to GemHCl;#.P<0.05,compared to GemC18.

給藥后24 h，在0.000 1、0.001 μmol/L兩個濃度點GemC18-PLGA-NPs組與GemC18和GemHCl組的SR無組間差異 (P>0.05)。 在0.01、 0.1、1、10 μmol/L濃度處GemC18-PLGA-NPs的SR明顯高于GemC18和GemHCl組(P<0.05)。GemC18組在0.000 1、0.001、0.01 μmol/L濃度處與GemHCl組無明顯組間差異(P>0.05)，在0.1、1、10 μmol/L濃度處，兩組間存在差異(P<0.05)，見圖2。

給藥48 h后，GemC18-PLGA-NPs在各個濃度的SR均高于GemHCl組，GemC18-PLGA-NPs與GemHCl組均存在顯著的組間差異(P<0.05)，GemC18-PLGA-NPs與GemC18組在濃度0.000 1、0.001、10 μmol/L處無明顯組間差異(P>0.05)，在濃度0.01、0.1、1 μmol/L處存在組間差異(P<0.05)。GemC18組與GemHCl組在濃度10 μmol/L無組間差異(P>0.05)，GemC18組在濃度0.000 1、0.001、0.01、0.1、1 μmol/L的SR均高于GemHCl組，存在明顯組間差異(P<0.05)，見圖3。

給藥72 h后，GemC18-PLGA-NPs組與GemC18組和GemHCl組在0.000 1、0.001、10 μmol/L濃度處的SR無組間差異(P>0.05)，在0.01、0.1、1 μmol/L濃度處的SR均高于GemC18組和GemHCl組存在組間差異(P<0.05)。GemC18與GemHCl在0.000 1、0.001、1、10 μmol/L濃度無組間差異(P>0.05)，在0.01、0.1 μmol/L濃度處存在組間差異(P<0.05)。PLGA-NPs組的SR在24、48和72 h的每個濃度點均在80%以上，大于其他給藥組的SR，見圖4。

2.2細胞存活率的濃度和時間依賴性 圖2結果提示：(1)給藥后24、48、72 h，GemC18-PLGA-NPs、GemC18、GemHCl組的SR與給藥濃度均呈負相關，但GemHCl組在1 μmol/L后似已進入平臺期，而GemC18-PLGA-NPs組的SR曲線仍下降明顯。PLGA-NPs組的存活率并無濃度依賴性。(2)GemC18-PLGA-NPs、GemC18和GemHCl組的SR均具有明顯的時間依賴性(P<0.05)，PLGA-NPs組的存活率不具有明顯的時間依賴性(P>0.05)。實驗結果顯示GemC18-PLGA-NPs對LLC細胞有一定的時間延續(xù)性，表明藥物具有一定的緩釋作用。

圖2 藥物作用24、48、72 h后細胞存活率(MTT法)Fig.2 SR of different groups after 24,48,72 h(MTT method)Note: *.P<0.05,compared to GemHCl;#.P<0.05,comared to GemC18.

圖3 藥物作用48 h和72 h后各組細胞凋亡率(FACS)Fig.3 Apoptosis of different groups after 48 h or 72 h by FACS

Groups48h72hControl29 83±0 9633 86±8 37PLGA?NPs31 24±3 5638 88±3 17GemHCl94 44±1 6796 88±1 49GemC1873 00±11 301)87 30±3 311)GemC18?PLGA?NPs56 92±4 431)2)68 05±2 701)2)

Note：1)P<0.05,compared to GemHCl;2)P<0.05,compared to GemC18.

2.3不同藥物組的細胞凋亡率 給藥后48、72 h，GemC18組和GemC18-PLGA-NPs組與GemHCl組的細胞凋亡率相比均存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，72 h，GemC18與GemHCl組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。GemC18與GemC18-PLGA-NPs相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PLGA-NPs組與Control組相比差異無統(tǒng)計學意義，PLGA-NPs組對細胞的凋亡無明顯影響。見圖3、表1。

3 討論

吉西他濱是脫氧胞苷的水溶性類似物，主要通過競爭性抑制DNA合成的相關酶而阻止細胞的分裂和增殖，最終導致腫瘤細胞死亡。被批準用于治療胰腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌等惡性腫瘤[2]。然而，吉西他濱存在幾個缺點，例如靜脈注射后被胞嘧啶脫氨酶快速脫氨基轉變?yōu)闊o活性的2′-2′-二氟脫氧尿苷，使其失去了抗腫瘤作用，吉西他濱因核糖核苷酶還原酶M1亞型(RRM1)過表達而產(chǎn)生耐藥[3,4]，半衰期短、毒性強等。在吉西他濱分子基團的N4位引入硬脂酰基，形成的前藥4-(N)-stearoylgemcitabine(GemC18)對血漿脫氨酶不敏感，可以保護吉西他濱免受脫氨酶的脫氨作用，提高了吉西他濱的代謝穩(wěn)定性[5,6]。GemC18是吉西他濱的脂肪酸酰胺前藥，經(jīng)酰胺酶水解后可釋放母體藥物吉西他濱，延長了吉西他濱的半衰期。吉西他濱的酰胺衍生物GemC18在腫瘤細胞內釋放出吉西他濱，向其他組織擴散減少，減輕了局部毒性，細胞內藥物蓄積增加，抗腫瘤活性增加。PLGA是FDA批準的可生物降解和生物相容的聚合物，降解產(chǎn)物乳酸和羥基乙酸可參與人體的新陳代謝，最終生成二氧化碳和水排出體外[7]。PLGA顆?？捎米鱃emC18載體。在延長體內循環(huán)時間，增加在腫瘤組織的藥物分布，達到靶向治療腫瘤的目的等方面有重要作用[8]。PLGA可通過改變形成的顆粒大小而調節(jié)由PLGA制備的顆粒的藥物釋放速率[8-10]。

本實驗采用了MTT法檢測了GemC18-PLGA-NPs、GemC18和GemHCl對Lewis肺癌細胞株的體外增殖抑制作用，結果顯示：(1)GemC18-PLGA-NPs和GemC18在制備過程中并無吉西他濱藥效的減損，仍然具有顯著的細胞抑制作用；(2)72 h后，GemHCl似在1 μmol/L濃度處已進入平臺期，而GemC18-PLGA-NPs的曲線繼續(xù)下降，說明GemC18-PLGA-NPs可伴隨著濃度的加大而增強對腫瘤細胞的抑制作用，并具有時間延續(xù)性；(3)PLGA-NPs組沒有明顯的增殖抑制作用，細胞存活率均在80%以上，也沒有明顯的時間及濃度相關性，提示PLGA納米顆粒具有良好的生物相容性，有廣泛的臨床應用前景。

關于實驗結果涉及的幾點問題：(1)被吞噬功能：由于GemHCl具有很強的水溶性，其進入細胞依賴細胞膜的核苷轉運蛋白[8]；而GemC18-PLGA-NPs可以通過先釋放出GemC18再釋放出GemHCl然后進入細胞的途徑，也可通過納米顆粒被細胞整體吞噬的途徑進入；因此在細胞膜的核苷轉運蛋白達到飽和以后仍可以進入腫瘤細胞。這可能是GemHCl在1 μmol/L濃度以后藥物作用不再隨著濃度增加而增大，而GemC18-PLGA-NPs對腫瘤細胞存活率仍然繼續(xù)下降的主要原因。(2)緩釋功能：GemC18-PLGA-NPs在72 h后，10 μmol/L濃度處細胞具有較低的存活率，在1 μmol/L濃度以后具有存活率-濃度負相關，這種現(xiàn)象可能與納米顆粒的緩釋作用有關。GemC18-PLGA-NPs可以通過藥物的緩釋作用避免細胞膜轉運蛋白的過飽和，也可避免因血漿酰胺酶的水解作用而使藥物失去活性。GemC18-PLGA-NPs可通過胞吞作用進入腫瘤細胞內遵循先釋放GemC18，再釋放出GemHCl的遲緩過程，具體表現(xiàn)為給藥后72 h的細胞存活率低于給藥后24 h和48 h。

由于體內外環(huán)境的差異極大，本實驗僅初步檢測GemC18-PLGA-NPs對LLC細胞的體外增殖抑制作用和對細胞凋亡的影響，尚難以體現(xiàn)其更多的藥物緩釋優(yōu)勢，后續(xù)仍需進行Lewis肺癌細胞的荷瘤小鼠模型等體內實驗以進一步證實。

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