葛一漫 胡一梅 王 毅 馬 韜 張靈玲 雍江堰 張朝明

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

急性濕疹(Atopic eczema，AE)是一類(lèi)臨床上常見(jiàn)的皮膚病，瘙癢是急性濕疹的最基本的臨床特征，更是判斷病情的主要依據(jù)。產(chǎn)生瘙癢的信號(hào)通路主要有兩條，即組胺依賴(lài)的信號(hào)通路和非組胺依賴(lài)信號(hào)通路，其中TRPV1是這兩條通路共同的下游信號(hào)，是瘙癢產(chǎn)生的關(guān)鍵分子。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)運(yùn)用馬齒莧提取液治療急性濕疹大鼠，觀察大鼠皮膚的濕疹嚴(yán)重程度，結(jié)合造模區(qū)H1R、PAR-2和TRPV1的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，對(duì)比組胺依賴(lài)的癢信號(hào)通路和非組胺依賴(lài)的PAR-2途徑，探討馬齒莧提取液控制急性濕疹瘙癢癥狀的可能機(jī)制及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雌雄不限，體重180～220 g[成都達(dá)碩生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(111)2008-24]。實(shí)驗(yàn)室溫度保持在(24±2)℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%，嚴(yán)格按照12 h/12 h明暗交替光照。

1.1.2藥物與試劑 馬齒莧提取液(采用去根馬齒莧鮮草榨汁獲得)； DNCB購(gòu)自成都科龍化工試劑廠(批號(hào)：20090813)；一抗H1R(克隆號(hào)：bs-663R)、PAR-2(克隆號(hào)：bs-1178R)、TRPV1(克隆號(hào)：bs-1931R)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二抗及相應(yīng)試劑盒及陽(yáng)性片購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司；病理圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus6.0，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及造模 大鼠30只，隨機(jī)分為正常組、模型組、馬齒莧組，每組10只。大鼠腹部采用5%DNCB 30 μl進(jìn)行首次致敏，之后每隔2 d，對(duì)大鼠右背部采用0.2%DNCB 50 μl進(jìn)行二次抗原攻擊3次。第9天觀察大鼠造模區(qū)是否出現(xiàn)濕疹癥狀。第10天起各組大鼠分別給予相應(yīng)藥物進(jìn)行治療，連續(xù)9 d。所有實(shí)驗(yàn)均根據(jù)赫爾辛基宣言和保護(hù)及運(yùn)用動(dòng)物的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2.2實(shí)驗(yàn)取材 斷頸處死動(dòng)物，取大鼠造模區(qū)皮膚一塊，10%中性甲醛溶液中固定48 h，待做免疫組化檢查。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1一般情況觀察及濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)(Eczema area and severity index,EASI)評(píng)分 具體方法參見(jiàn)《濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法》[1]。

1.2.3.2免疫組化染色各組大鼠皮膚H1R、PAR-2、TRPV1及其含量的測(cè)定 取固定后的大鼠皮膚組織，進(jìn)行洗滌、脫水、包埋、切片、加一抗、加二抗，封片后顯微鏡下觀察H1R、PAR-2、TRPV1免疫組化染色切片，首先在低倍(×100)下觀察陽(yáng)性物質(zhì)分布、范圍及位置，選擇陽(yáng)性物質(zhì)最明顯處(“熱點(diǎn)”)5個(gè)視野，然后在中倍(×200)下，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量檢測(cè)上述5個(gè)視野陽(yáng)性物質(zhì)的積分光密度(IOD)，計(jì)算平均IOD，表示H1R、PAR-2、TRPV1含量。

1.2.3.3細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm。隨機(jī)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，取2×104個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值的平均值為每份樣品Ca2+濃度的測(cè)定值。并按以下公式計(jì)算出各組Ca2+濃度：[Ca2+]=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)。式中Kd為熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數(shù)；F為不同條件下測(cè)定的平均熒光強(qiáng)度值。

2 結(jié)果

2.1各實(shí)驗(yàn)組EASI的檢測(cè)結(jié)果[1]由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠EASI均有顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，馬齒莧組大鼠EASI均有顯著減小(P<0.01)。

2.2各組大鼠皮膚組織H1R、PAR-2和TRPV1觀察檢測(cè)結(jié)果 由圖1、表2可知，與正常組比較，模型組H1R(P<0.05)、PAR-2(P<0.01)明顯增加，TRPV1含量有所增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，馬齒莧組H1R、PAR-2明顯減少(P<0.01)，TRPV1含量有所減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3對(duì)KC內(nèi)Ca2+濃度的影響 由表3可知，與正常組比，KC內(nèi)Ca2+濃度顯著增加(P<0.01)；與模型組比，KC內(nèi)Ca2+濃度均顯著減少(P<0.05)。

GroupsEASI[1]Normalcontrol0 00±0 00Model14 24±2 231)Portulacaextracts1 92±0 242)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.01.

GroupsnH1RPAR?2TRPV1Normalcontrol100 1572±0 00380 1534±0 00220 1606±0 0121Model100 1695±0 00912)0 1708±0 01151)0 1682±0 0133Portulacaextracts100 1604±0 01213)0 1541±0 00683)0 1620±0 0057

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model group,3)P<0.01.

圖1 皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1的表達(dá)(免疫組化染色，×200)Fig.1 Expression of H1R，PAR-2 and TRPV1 in skin tissue(immunohistochemical staining,×200)

GroupsnCa2+(μmol/L)Normalcontrol100 75±0 13Model103 49±0 411)Portulacaextracts101 16±0 152)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05.

3 討論

急性濕疹所致的皮膚瘙癢常由內(nèi)、外源性化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)，多條信號(hào)通路共同傳遞。目前認(rèn)為，皮膚瘙癢的發(fā)生主要通過(guò)兩個(gè)途徑：組胺依賴(lài)的癢信號(hào)通路、非組胺依賴(lài)的PAR-2途徑[2]。兩條信號(hào)通路的共同下游信號(hào)分子是TRPV1，是癢覺(jué)通路傳遞的樞紐。TRPV1主要對(duì)Ca2+具有通透性，通過(guò)介導(dǎo)Ca2+的跨膜流動(dòng)及細(xì)胞器中Ca2+的釋放提供通道，改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[3-5]。馬齒莧，早在《本草綱目》中就有記載，具有清火解濕、瀉熱祛腐等功效，主治惡瘡、疔瘡腫毒、風(fēng)結(jié)瘡丹毒和禿瘡濕癬等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[6]，馬齒莧主要含有不飽和脂肪酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、揮發(fā)油等活性成分，具有消炎抑菌、增強(qiáng)免疫的作用，用于治療濕疹、瘙癢癥等風(fēng)熱、濕熱類(lèi)的皮膚病，療效顯著。

組胺依賴(lài)的癢信號(hào)通路可由組胺激活，通過(guò)一類(lèi)機(jī)械刺激不敏感的無(wú)髓鞘C-纖維(Mechanically-insensitive C-fibers，CMi)介導(dǎo)。在真皮和表皮的分界處存在傳入神經(jīng)纖維亞單位。在Ca2+存在條件下，H1R首先激活磷脂酶C(Phospholipase C ，PLC)和磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA-2)，再活化下游TRPV1通道，增加Ca2+內(nèi)流[7,8]；同時(shí)，PLC可發(fā)生水解，其產(chǎn)物二?；视?Diacylglycerol，DAG)直接開(kāi)放TRPV1通道[9]，誘導(dǎo)產(chǎn)生癢覺(jué)。PAR-2途徑由一類(lèi)機(jī)械刺激熱敏感的C-纖維介導(dǎo)。類(lèi)胰蛋白酶是PAR-2的有效激活劑。類(lèi)胰蛋白酶首先激活 PAR-2，PAR-2的激活促使PLC活化，PLC進(jìn)一步增加下游蛋白激酶C的表達(dá)，最后使下游TRPV1通道開(kāi)放，增加Ca2+內(nèi)流；同時(shí)，PAR-2可以通過(guò)激活蛋白激酶 A，增加 TRPV1 活性[10]，誘導(dǎo)產(chǎn)生癢覺(jué)。

我們前期實(shí)驗(yàn)證明馬齒莧對(duì)急性濕疹有較顯著的治療作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與正常組比較，模型組急性濕疹大鼠皮膚H1R、 PAR-2含量以及KC內(nèi)Ca2+濃度顯著增多，TRPV1有所增高，但無(wú)顯著性差異，結(jié)果提示大鼠急性濕疹的形成特別是瘙癢的產(chǎn)生是通過(guò)組胺信號(hào)通路與非組胺信號(hào)通路共同發(fā)揮作用，但TRPV1含量沒(méi)有顯著增高，推測(cè)其作用機(jī)制是通過(guò)激活H1R和PAR-2，進(jìn)一步激活TRPV1通道，增強(qiáng)TRPV1活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，產(chǎn)生瘙癢，這與Kim[9]、Reddy[10]等報(bào)道一致；用藥后，與模型組比，馬齒莧組 H1R 、PAR-2含量以及KC內(nèi)Ca2+濃度顯著減低，TRPV1有所減少，但無(wú)顯著性差異，結(jié)果提示，馬齒莧的抗瘙癢的作用是通過(guò)組胺信號(hào)通路與非組胺信號(hào)通路發(fā)揮作用，推測(cè)其機(jī)制是通過(guò)抑制H1R 和PAR-2，進(jìn)一步抑制TRPV1通道，降低其活性，導(dǎo)致Ca2+濃度減少，控制瘙癢。但馬齒莧提取液調(diào)控TRPV1通道開(kāi)放及對(duì)TRPV1活性的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，模型組中PAR-2表達(dá)的增加高于H1R，用藥后，馬齒莧對(duì)PAR-2的抑制作用也比H1R更為明顯，推測(cè)在急性濕疹產(chǎn)生的瘙癢信號(hào)通路中，PAR-2途徑比組胺依賴(lài)的信號(hào)通路作用更大，但其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜述所述，大鼠急性濕疹特別是瘙癢的產(chǎn)生及馬齒莧提取液對(duì)其治療的作用機(jī)制可能是通過(guò)組胺依賴(lài)性信號(hào)通路和非組胺依賴(lài)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。TRPV1是上述兩條通路的共同下游信號(hào)分子，TRPV1數(shù)量改變、活性狀態(tài)改變，與急性濕疹特別是瘙癢的產(chǎn)生、消退顯著相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持，TRPV1活化可導(dǎo)致急性濕疹瘙癢，馬齒莧則是通過(guò)降低TRPV1活性狀態(tài)發(fā)揮治療急性濕疹瘙癢的作用。

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