呂 霞 吳 沙 何 林 辜剛鳳 彭紅艷 李經(jīng)綸

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州 646000)

一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(Delayed encephalo-pathy after carbon monoxide posioning，DEACMP)是指一氧化碳中毒患者積極治療后經(jīng)過(guò)2～60 d表現(xiàn)正常或基本正常的假愈期后，出現(xiàn)以智能障礙、精神行為異常為主的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率約為10%～30%[1]。其發(fā)病機(jī)制多種多樣，從而導(dǎo)致DEACMP尚缺乏有效的治療措施。近年來(lái)，氧化應(yīng)激損傷機(jī)制在疾病中的作用越來(lái)越受到重視，Nrf2/ARE/HO-1通路是體內(nèi)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的主要途徑之一，最近一項(xiàng)研究表明Nrf2在DEACMP的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用[2]。叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ),一種Nrf2特異性激活劑，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病多種模型如腦外傷[3]、蛛網(wǎng)膜下腔出血[4]中已經(jīng)證明了它的神經(jīng)保護(hù)作用,但在DEACMP中的研究很少。本文通過(guò)改良式腹腔注射一氧化碳制作大鼠DEACMP模型，利用tBHQ進(jìn)行干預(yù)，再通過(guò)免疫組織化學(xué)、TUNEL染色、蛋白免疫印跡等方法比較干預(yù)劑前后大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及Nrf2、HO-1的表達(dá)變化情況，從而進(jìn)一步探討DEACMP的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為其靶向治療的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 250 g左右SD大鼠(由西南醫(yī)科大學(xué)城北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，純度為99.9%的一氧化碳?xì)怏w(由瀘州市西南化工研究室提供)，Morris水迷宮分析跟蹤系統(tǒng)(由西南醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室提供)，血?dú)夥治鰞x(雅培公司，美國(guó))，CXL生物顯微鏡(徠博公司,美國(guó)),石蠟切片機(jī)(BRIGHT公司，英國(guó))，叔丁基對(duì)苯二酚(Sigma公司，美國(guó))，兔抗鼠Nrf2及HO-1多克隆抗體均(圣克魯斯生物技術(shù)公司，中國(guó))，TUNEL試劑盒(嘉美諾斯生物科技有限公司，中國(guó))，Western熒光檢測(cè)試劑(Roche公司，德國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組 將240只SD成年大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為一氧化碳中毒組(CO組)、空氣對(duì)照組(AC組)、一氧化碳+3%乙醇組(EC組)、一氧化碳+tBHQ組(TC組)，再將各組大鼠按染毒后1、3、7、14、21、28 d隨機(jī)分為6個(gè)亞組，每個(gè)亞組均為5只。

1.2.2動(dòng)物模型制備 采用改良式腹腔注射一氧化碳法制備大鼠DEACMP模型[5]，其中CO組、EC組、TC組一氧化碳量按首次劑量100 ml/kg進(jìn)行腹腔注射，每隔4 h追加一次，追加劑量為首次劑量的一半(即50 ml/kg)，共追加3次；AC組用等量空氣腹腔注射；TC組各個(gè)亞組在造模成功后隨即給予腹腔注射叔丁基對(duì)苯二酚(劑量為50 mg/kg，用3%乙醇按5 mg/ml濃度配比[6,7])每天一次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；EC組在同一時(shí)間腹腔注射等量3%乙醇。

1.2.3血HbCO監(jiān)測(cè)及水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型制作的成功 每個(gè)亞組隨機(jī)選取一只大鼠，分別在染毒后15 min、0.5、2、4、8、12、16 h股動(dòng)脈采血1 ml，全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x測(cè)定HbCO濃度，同時(shí)觀察大鼠染毒后的癥狀及體征，后者檢驗(yàn)大鼠的認(rèn)知及記憶能力。

1.2.4取材 各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，每個(gè)亞組中一半大鼠處死后去頭取出腦組織，置于冰面上分離出整個(gè)海馬，之后于-80℃冰箱保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。另一半大鼠麻醉后心臟灌洗和4%多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于甲醛中固定24 h后，用石蠟包埋，制作組織切片、免疫組織化學(xué)檢測(cè)、TUNEL檢測(cè)。

1.2.5病理組織學(xué)觀察 將包埋好的石蠟塊經(jīng)切片貼片、脫蠟染色(蘇木精-伊紅染色)、脫水透明、封片。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測(cè)Nrf2及HO-1的表達(dá) 嚴(yán)格按照說(shuō)明書染色步驟進(jìn)行，常規(guī)脫蠟及水化，高溫修復(fù)抗原，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性后，孵育一抗，浸泡，孵育二抗，經(jīng)DBA顯色、蒸餾水漂洗后經(jīng)蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊高倍視野，采用兼顧陽(yáng)性細(xì)胞所占比例與著色強(qiáng)度相結(jié)合的綜合評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，用半定量人工計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析[8]。其中，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：<25%記1分，25%～50%記2分，5%～75%記3分，>75%記4分；染色強(qiáng)度：淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分，最后取5個(gè)視野二者乘積的算術(shù)均數(shù)作為每只大鼠的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)分?jǐn)?shù)。

1.2.7Western blot檢測(cè)Nrf2及HO-1的表達(dá) 將海馬組織置于勻漿器中，用剪刀盡量剪碎，超聲裂解、充分碾碎，離心，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，免疫顯色，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，用凝膠處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶及內(nèi)參條帶的灰度值。

1.2.8細(xì)胞凋亡檢測(cè) 嚴(yán)格按照TUNEL檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行，常規(guī)脫蠟及水化，高溫抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性后，滴加TUNEL反應(yīng)液發(fā)生酶標(biāo)反應(yīng)，DAB顯色，封片后觀察，陽(yáng)性細(xì)胞顯色為棕黃色，計(jì)算凋亡指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠中毒后的表現(xiàn) CO組、EC組、TC組大鼠于CO腹腔注射后10～15 min左右出現(xiàn)躁動(dòng)、呼吸淺快，20 min后逐漸出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少、站立不穩(wěn)，口唇櫻桃紅色，四肢癱軟，少部分大鼠出現(xiàn)大小便失禁、抽搐、昏迷，立即將大鼠放置空氣流通處，上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，淘汰無(wú)變化大鼠，整個(gè)染毒過(guò)程中死亡大鼠11只，立即予以備用大鼠補(bǔ)齊。將死亡大鼠立即解剖，發(fā)現(xiàn)其臟器尤其肝臟及腦組織充血水腫明顯。

2.2動(dòng)脈血HbCO濃度變化及Morris測(cè)驗(yàn)結(jié)果 大鼠染毒后15 min HbCO濃度迅速增高至65%以上，隨后大鼠體內(nèi)HbCO仍有增高，于0.5 h達(dá)濃度高峰(70%左右)，行第1次追加CO時(shí)大鼠體內(nèi)HbCO濃度仍>50%以上，間隔注射CO可使大鼠體內(nèi)HbCO>50%持續(xù)16 h以上。Morris水迷宮結(jié)果表示，隨著大鼠染毒時(shí)間的延長(zhǎng),于14～28 d CO組、EC組、TC組平均逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)運(yùn)動(dòng)總時(shí)間減少，各組內(nèi)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CO組與EC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CO組與TC組比較7 d內(nèi)三種參數(shù)無(wú)明顯差異，14～21 d 平均潛伏期延長(zhǎng)更久，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)運(yùn)動(dòng)總時(shí)間減少更明顯(P<0.05)。

2.3免疫組化結(jié)果 AC組大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及HO-1表達(dá)很少，各亞組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CO組、EC組、TC組大鼠海馬區(qū)Nrf2及HO-1表達(dá)均表現(xiàn)為染毒后第1天升高，3 d達(dá)高峰(各組內(nèi)3～7 d與其余時(shí)間點(diǎn)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，隨后逐漸下降的趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)與AC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EC組與CO組比較各時(shí)間點(diǎn)Nrf2及HO-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TC組與CO組比較Nrf2及HO-1表達(dá)增高，各亞組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1、2，圖1。

2.4TUNEL檢測(cè)結(jié)果 AC組大鼠海馬CA1區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞較少，CO組、EC組、TC組大鼠與AC組比較凋亡細(xì)胞隨時(shí)間明顯增多，且均表現(xiàn)為增高-高峰(7～14 d)-降低的趨勢(shì)。CO組與EC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TC組與CO組比較凋亡細(xì)胞(7～14 d)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、圖2。

Groupsnd1d3d7d14d21d28Aircontrolgroup51 80±0 211 75±0 361 81±0 301 90±0 401 78±0 261 80±0 27Carbonmonoxidegroup54 00±0 911)7 49±1 221)6 29±0 201)4 80±0 421)4 20±1 471)3 80±1 351)Carbonmonoxide+3%ethanol54 05±1 071)7 52±1 341)6 41±1 141)4 02±0 711)4 16±0 651)4 00±1 191)Carbonmonoxide+tBHQ56 28±1 571)2)10 64±1 191)2)9 51±0 931)2)6 93±1 851)2)6 62±1 391)2)6 20±1 781)2)F14 84856 50086 22220 10316 8769 944P<0 001<0 001<0 001<0 001<0 0010 001

Note：Compared with the blank control group，1)P<0.05;compared with the group of carbon monoxide poisoning，2)P<0.05.

Groupsnd1d3d7d14d21d28Aircontrolgroup51 70±0 151 90±0 242 00±0 301 70±0 241 80±0 201 90±0 19Carbonmonoxidegroup53 60±1 401)8 00±0 961)7 40±1 181)4 50±0 881)4 20±0 971)3 10±1 151)Carbonmonoxide+3%ethanol54 30±1 051)8 24±1 421)7 50±0 941)5 00±0 901)4 50±1 171)3 70±0 231)Carbonmonoxide+tBHQ56 80±0 751)2)11 20±0 981)2)10 70±0 741)2)7 60±1 631)2)7 50±0 741)2)7 00±0 521)2)F24 50376 71789 36727 14037 96657 030P<0 001<0 001<0 001<0 001<0 001<0 001

Note：Compared with the blank control group，1)P<0.05;compared with the group of carbon monoxide poisoning，2)P<0.05.

圖1 染毒后3 d海馬CA1區(qū)Nrf2和HO-1免疫組化染色結(jié)果(×400)Fig.1 Immunohistochemistry results of Nrf2 and HO-1 after 3 days in CA1 area of hippocampus(×400)Note: 1.Results of Nrf2;2.Results of HO-1.A.Air control group;B.Carbon monoxide group;C.Carbon monoxide+tHBQ group.

Groupsnd1d3d7d14d21d28Aircontrolgroup54 60±0 384 30±0 854 80±0 944 00±0 694 50±0 724 00±0 39Carbonmonoxidegroup59 90±3 091)12 19±2 171)20 39±1 151)18 80±2 191)13 10±2 321)10 50±2 211)Carbonmonoxide+3%ethanol59 20±2 651)11 90±1 901)20 50±3 531)18 00±2 801)12 90±3 501)9 80±3 261)Carbonmonoxide+tBHQ58 70±2 921)2)9 50±2 161)2)16 18±2 161)2)14 50±0 981)2)10 50±2 061)2)9 50±3 801)2)F4 49219 41056 36865 69014 3125 946P0 018<0 001<0 001<0 001<0 0010 006

Note：Compared with the blank control group，1)P<0.05;compared with the group of carbon monoxide poisoning，2)P<0.05.

圖2 各組大鼠染毒后7 d海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞(TUNEL染色，×400)Fig.2 Apoptotic cells in hippocampus CA1 region of rats in each group were exposed after 7 d (TUNEL staining，×400)Note: A.Air control group;B.Carbon monoxide group;C.Carbon monoxide+tHBQ group.

圖3 大鼠海馬區(qū)Nrf2及HO-1蛋白免疫印跡法結(jié)果Fig.3 Results of Nrf2 and HO-1 protein immunoblotting in hippocampus of rats

2.5Western blot檢測(cè)結(jié)果 AC組大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及HO-1表達(dá)很少。CO組、EC組、TC組大鼠海馬區(qū)Nrf2及HO-1表達(dá)均表現(xiàn)為染毒后升高-高峰(3～14 d)-降低的趨勢(shì)，至28 d時(shí)仍高于染毒前水平，且TC組較CO組因子表達(dá)明顯增高，見(jiàn)圖3。

2.6相關(guān)性分析 可知CO組大鼠海馬區(qū)Nrf2與HO-1成正相關(guān)(r=0.901,P<0.001),Nrf2與凋亡指數(shù)成正相關(guān)(r=0.489,P<0.05),HO-1與凋亡指數(shù)成正相關(guān)(r=0.430,P<0.05)。TC組大鼠海馬區(qū)Nrf2與HO-1成正相關(guān)(r=0.894，P<0.001),3～14 d Nrf2與凋亡指數(shù)成負(fù)相關(guān)(r=-0.492,P=0.062),3～14 d HO-1與凋亡指數(shù)成負(fù)相關(guān)(r=-0.597,P<0.05)。

3 討論

DEACMP發(fā)病率高、致殘率高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，大量專家就其機(jī)制及治療進(jìn)行了研究，但仍不明確。隨著氧化應(yīng)激損傷在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用受到重視，Nrf2/ARE通路在DEACMP中的作用也受到關(guān)注，旨在為其臨床靶向治療提供方向。Cap′n′collar(CNC)調(diào)節(jié)蛋白家族包括四個(gè)成員：Nrf1、Nrf2、Nrf3和p45 NF-E2[9]。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中敲除Nrf2基因的大鼠對(duì)氧化應(yīng)激不敏感[10]。由此Nrf2可能是細(xì)胞適應(yīng)氧化應(yīng)激的主要調(diào)解因子。隨著對(duì)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的研究越來(lái)越深入，我們對(duì)Nrf2的了解也越來(lái)越多。它是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，也是CNC家族中活性最強(qiáng)的因子，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2隨即解偶聯(lián)進(jìn)入胞核中，通過(guò)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與小Maf形成異二聚體識(shí)別并與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element，ARE)上的相關(guān)序列結(jié)合，從而激活一系列細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，包括生物轉(zhuǎn)化酶、抗氧化蛋白、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抗凋亡蛋白和蛋白酶體[11]，最典型的有HO-1、醌氧化還原酶[12]。Nrf2誘導(dǎo)劑很多，如姜黃素、芍藥醇、萊菔硫烷、叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)等，其中tBHQ研究最多，是一種具有固有抗氧化性能的酚類化合物[13]，在食品工業(yè)中廣泛用作抗氧化劑和防腐劑[14]。研究表明，在氧化應(yīng)激損傷時(shí)，tBHQ在防止功能障礙方面是有效的，tBHQ通過(guò)增加Nrf2的穩(wěn)定性及抑制Keap1泛素化發(fā)揮其抗氧化功能[15]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良式腹腔注射CO法制作大鼠DEACMP模型，簡(jiǎn)單易操作，影響因素少，隨機(jī)抽取大鼠股動(dòng)脈血?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)HbCO濃度>50%以上可持續(xù)16 h以上，明顯提高了大鼠DEACMP的發(fā)生率，隨后的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，CO組、EC組、TC組大鼠在染毒14 d后平均潛伏期較對(duì)照組均有不同程度的延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)運(yùn)動(dòng)總時(shí)間也較對(duì)照組減少，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在7 d內(nèi)此差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，此表現(xiàn)與臨床上急性CO中毒后假愈期相符。結(jié)合CO組、EC組大鼠Nrf2的表達(dá)趨勢(shì)及凋亡細(xì)胞趨勢(shì)，我們推測(cè)在急性CO中毒后Nrf2在早期發(fā)揮抗氧化作用減少細(xì)胞凋亡，后期過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致DEACMP的發(fā)生，這與臨床上DEACMP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相符合[16]，我們的前期實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)[2]，同時(shí)也與國(guó)外專家的研究結(jié)果一致[17]。TC組大鼠Nrf2的表達(dá)與CO組比較各亞組均明顯增高(P<0.05)，且Nrf2與凋亡指數(shù)(3～14 d)成負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步說(shuō)明tBHQ激活Nrf2使其表達(dá)增加，可能強(qiáng)化其早期發(fā)揮抗氧化作用，減少大鼠海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡。

血紅素加氧酶1(HO-1)，公認(rèn)的Nrf2調(diào)節(jié)的下游靶基因之一，也稱熱休克蛋白32，是Ⅱ相解毒酶的一種，也是血紅素氧合酶家族(HO)的成員之一，在各類細(xì)胞中作為氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)的關(guān)鍵分子[18]，屬于誘導(dǎo)型HO。生理狀態(tài)下，多在外周組織低水平表達(dá)，在腦組織中表達(dá)甚微，幾乎不能檢測(cè)到。機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)、在還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的存在下，HO-1氧化裂解產(chǎn)生膽綠素、Fe2+、CO，膽綠素隨后在胞漿酶膽綠素還原酶作用下轉(zhuǎn)化為膽紅素 ，以上四種代謝產(chǎn)物均能發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用[19]。我們的早期實(shí)驗(yàn)表明HO-1在DEACMP中發(fā)揮著抗凋亡和促凋亡的雙重作用[20]。本實(shí)驗(yàn)中CO組、EC組大鼠HO-1的表達(dá)趨勢(shì)與Nrf2的表達(dá)趨勢(shì)一致，Western blot對(duì)蛋白進(jìn)行半定量與免疫組化結(jié)果一致，且Nrf2與HO-1成正相關(guān)，Nrf2、HO-1與細(xì)胞凋亡成正相關(guān)，由此推測(cè)Nrf2的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了HO-1的表達(dá)，隨之HO-1的代謝產(chǎn)物增多，早期共同發(fā)揮抗氧化作用，后期產(chǎn)生毒性作用，共同引起DEACMP的發(fā)生。TC組大鼠HO-1的表達(dá)與CO組比較各亞組均明顯增高(P<0.05)，且HO-1與凋亡指數(shù)(3～14 d)成負(fù)相關(guān)，同時(shí)Nrf2與HO-1成正相關(guān)，推測(cè)tBHQ激活Nrf2使其表達(dá)增加，其下游靶基因HO-1也隨之增加，二者早期共同保護(hù)細(xì)胞抗凋亡。

綜上，Nrf2/ARE/HO-1通路在DEACMP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，越來(lái)越多專家研究以激活該通路來(lái)達(dá)到DEACMP的靶向治療[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中tBHQ通過(guò)激活Nrf2使其表達(dá)增加，HO-1也隨之增加，這與Bajpai等[23]研究結(jié)果一致，二者共同作用使急性CO中毒大鼠早期細(xì)胞凋亡減少，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TC組大鼠行為學(xué)改變更輕，由此推測(cè)tBHQ通過(guò)激活Nrf2/ARE/HO-1通路可能會(huì)在一定程度上減輕DEACMP。

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