鄭 茜 張 勇 楊東偉

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內科，鄭州 450000)

越來越多的研究表明小RNA(microRNAs,miRNAs)在動脈粥樣硬化的病理生理細胞效應及分子信號通路中起著重要的調控作用[1]。MiRNAs是一類小非編碼RNA序列，長約22個核苷酸，目前已發(fā)現(xiàn)2 042種miRNAs[2]。這些miRNAs共同調控著基因組中三分之一的基因，而且miRNAs與多種疾病相關[3]。MiRNAs在神經性疾病、哮喘及癌癥等疾病中都起著重要作用[4-8]。MiR-126在多種癌癥中都低表達，可通過抑制癌細胞生長、遷移及侵襲等影響癌癥進程[9]。MiR-126在心血管疾病中也具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)血漿中的miR-126水平與冠狀動脈側支循環(huán)形成呈正相關[10]。有數(shù)據(jù)顯示在伴有多種血管疾病的冠狀動脈疾病患者中miR-126低表達[11]。在心肌缺血再灌注損傷中，miR-126表達下調，miR-126可保護由缺血再灌注引發(fā)的心肌細胞凋亡[12]。大量文獻報道m(xù)iR-126具有保護血管和動脈粥樣硬化的功能[13]。過表達miR-126可減弱靜脈內皮細胞凋亡抑制深靜脈血栓形成[14]。有研究表明內皮微顆粒可通過向受體細胞輸送功能性的miR-126來促進血管內皮修復[15]。本文主要目的是利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)處理人主動脈血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)，研究miR-126對oxLDL處理的VSMC生物學功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 人主動脈血管平滑肌細胞系T/G HAVSMC購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)；oxLDL購自美國Kalen Biomedical公司；促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路激活劑Anisomycin購自碧云天生物科技公司；SmGM-2培養(yǎng)基購自瑞士Lonza龍沙公司；胎牛血清及轉染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司；血脂檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒RNAiso Plus reagent購自大連TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；Transwell小室購自美國BD公司；增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody,Ki-67)和增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，遷移標記蛋白基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotein 9,MMP-9)和血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購自美國NEB公司；MAPK信號通路相關蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK和p-JNK抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理和轉染 人主動脈血管平滑肌細胞T/G HAVSMC于含5%胎牛血清的SmGM-2培養(yǎng)基中置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用生理鹽水處理T/G HAVSMC細胞24 h作為對照組，用50 mg/ml的oxLDL處理T/G HAVSMC細胞24 h作為模型組。依照轉染試劑TurboFect Transfection Regent說明書用miR-126 mimic和mimic control分別對模型組細胞進行轉染并添加MAPK信號通路激活劑Anisomycin。

1.2.2膽固醇及三酰甘油水平檢測 oxLDL處理T/G HAVSMC后收集細胞上清，按照試劑盒說明書測定總膽固醇(Serum total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipopro-tein cholesterol,HDL-C)和三酰甘油(Triglyceride,TG)。

1.2.3實時定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 用RNA提取試劑盒提取總RNA并反轉成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR。miR-126上游引物：GCTGTCAGTTTGTC-AAATAC，miR-126下游引物：GTGCAGGGTCC-GAGGT。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算miR-126的相對表達量。

1.2.4CCK-8檢測細胞增殖 轉染0、1、2、3、4、5 d后，CCK-8檢測各組細胞增殖倍數(shù)。首先將CCK-8溶液稀釋到10%，然后用上述稀釋液將待測的細胞制成1×106個/ml的懸液，37℃培養(yǎng)1～4 h，最后450 nm處檢測吸光值，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.2.5Transwell分析細胞遷移 待測細胞懸浮于無胎牛血清的培養(yǎng)基中至細胞密度為1×106個/ml，然后將細胞懸液加入到Transwell的上室中，在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后，0.5%的結晶紫對上室底部細胞進行染色，并用棉簽將上室內側的細胞除去。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并隨機選取5個視野統(tǒng)計每個視野下被染色的細胞數(shù)量。

1.2.6免疫印記 收集待測細胞，用PBS洗3次，然后加入已添加蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解后提取總蛋白。等量的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉至PVDF膜。用5%的BSA進行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后進行顯色。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1oxLDL對VSMC脂質代謝的影響 用50 mg/ml的oxLDL處理T/G HAVSMC細胞24 h后檢測模型組和對照組中TC、TG、LDL-C、HDL-C的濃度。如表1所示，模型組中TC、TG和LDL-C的濃度遠高于對照組，HDL-C的濃度則現(xiàn)顯著低于對照組(P<0.001)。這些指標的變化說明，oxLDL處理T/G HAVSMC后脂質代謝異常。

2.2oxLDL處理VSMC可降低miR-126表達 利用qRT-PCR檢測對照組和模型組中miR-126的表達，如圖1所示，模型組中miR-126相對表達量顯著降低(P<0.01)。由此可見，在oxLDL處理T/G HAVSMC的模型中miR-126下調表達。

2.3增強oxLDL處理的VSMC中miR-126的表達 將miR-126 mimic和mimic control分別轉染模型組細胞，qRT-PCR檢測各組細胞miR-126的表達情況。如圖2所示，模型組和mimic control組中miR-126的相對表達量顯著低于對照組(P<0.01)。miR-126 mimic組中miR-126的相對表達量遠遠高于模型組(P<0.001)。這些結果說明，miR-126 mimic轉染效果顯著，大大地提高了模型組細胞miR-126的表達。

GroupsTC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL?C(mmol/L)HDL?C(mmol/L)Control1 28±0 080 84±0 090 73±0 110 61±0 07Model6 78±0 161)5 89±0 181)7 08±0 231)0 39±0 051)

Note：TC.Total cholesterol;TG.Triglyceride;LDL-C.Low density lipoprotein cholesterin;HDL-C.High density lipoprotein cholesterol.Compared with control group,1)P<0.001.

2.4miR-126對oxLDL誘導的VSMC增殖的影響 為分析miR-126在oxLDL處理的VSMC中對細胞增殖的影響，利用CCK-8檢測各組細胞增殖倍數(shù)。圖3結果顯示，與對照組相比，oxLDL誘導的動脈粥樣硬化模型組和mimic control組細胞增殖倍數(shù)在轉染后第2天開始明顯增加(P<0.05)，轉染后第3天則顯著增多(P<0.01)，轉染4 d以后則極顯著升高了(P<0.001)。模型組中轉染miR-126 mimic后第3天開始細胞增殖倍數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)，轉染4 d以后增殖倍數(shù)顯著減少(P<0.01)。由此可見，miR-126 mimic可抑制oxLDL誘導的VSMC增殖的增加。

圖1 qRT-PCR檢測oxLDL處理后miR-126的表達Fig.1 Expression of miR-126 was tested by qRT-PCR after treatment with oxLDLNote: Compared with control group,**.P<0.01.

圖2 qRT-PCR檢測轉染miR-126 mimic后miR-126的表達Fig.2 Expression of miR-126 was tested by qRT-PCR after transfection with miR-126 mimicNote: Compared with control group,**.P<0.01;comprared with model group,###.P<0.001.

2.5miR-126在oxLDL處理的VSMC中對細胞遷移的影響 Transwell檢測各組細胞遷移結果顯示，模型組和mimic control組遷移細胞數(shù)最多，其次是miR-126 mimic組，對照組遷移細胞數(shù)最少(圖4A)。如圖4B所示，模型組和mimic control組中平均每個視野的遷移細胞數(shù)遠遠高于對照組(P<0.001)。與模型組相比，miR-126 mimic組遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.01)。上述結果表明，miR-126 mimic可減弱oxLDL對VSMC遷移能力的促進作用。

2.6miR-126對細胞增殖和遷移標記蛋白表達的影響 為進一步驗證miR-126在oxLDL處理的VSMC中對細胞增殖和遷移的影響，免疫印跡檢測各組細胞增殖和遷移標記蛋白表達。圖5A顯示，增殖和遷移標記蛋白Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF在模型組和mimic control組中表達最強，miR-126 mimic組較低，對照組表達最弱。由圖5B可知，模型組和mimic control組中Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF的相對表達量顯著高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，miR-126 mimic組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF的相對表達量明顯減少(P<0.05)。這些結果說明，oxLDL可增強VSMC中細胞增殖和遷移標記蛋白表達。

圖3 CCK-8檢測細胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by CCK-8Note: Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with model group,#.P<0.05,##.P<0.01.

圖4Transwell檢測細胞遷移(結晶紫染色,×100)

Fig.4MigrationwasmeasuredbyTranswell(crystalvioletstaining，×100)

Note: A.Crystal violet staining；B.Histogram represents the statistical analysis of Transwell migration.Compared with model group,***.P<0.001;compared with model group,##.P<0.01.

2.7miR-126對MAPK信號通路相關蛋白表達的影響 為探索miR-126在oxLDL處理的VSMC中的分子調控機制，免疫印跡分析MAPK信號通路相關蛋白的表達。如圖6A所示，磷酸化的蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK在模型組和mimic control組表達量最多，其次是miR-126 mimic，對照組中表達量最少，但各組細胞中ERK1/2、p38、JNK蛋白表達無明顯變化。圖6B顯示，與對照組相比，模型組和mimic control組中p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK的相對蛋白表達量的比值顯著升高(P<0.01)，miR-126 mimic組p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK的相對蛋白表達量的比值則明顯低于模型組(P<0.05)。由此可見，miR-126 mimic可降低oxLDL引起的VSMC中MAPK信號通路相關蛋白磷酸化水平的升高，抑制MAPK信號通路活化。

圖5 免疫印跡檢測細胞增殖和遷移標記蛋白的表達Fig.5 Expression of proliferation and migration marker proteins was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.Compared with control group,**.P<0.01；compared with model group,#.P<0.05.

圖6 免疫印跡檢測MAPK信號通路相關蛋白的表達Fig.6 Expression of MAPK pathway related proteins was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot;B.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.Compared with control group,**；P<0.01;compared with model group,#.P<0.05.

圖7 免疫印跡檢測細胞增殖和遷移標記蛋白的表達Fig.7 Expression of proliferation and migration marker proteins was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram represents the statistical analysis of Ki-67 and PCNA；C.Histogram represents the statistical analysis of MMP-9 and VEGF,compared with control group,**.P<0.01,compared with model group,#.P<0.05.

2.8miR-126通過MAPK信號通路發(fā)揮作用 為進一步確認miR-126是通過MAPK信號通路來發(fā)揮作用，添加MAPK信號通路激活劑Anisomycin檢測各組細胞增殖和遷移標記蛋白表達。圖7A顯示，增殖和遷移標記蛋白Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF在Anisomycin組中表達最高。如圖7B和7C所示，與對照組相比，模型組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-126 mimic組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達明顯降低(P<0.05)；Anisomycin組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達明顯升高(P<0.05)。miR-mimic+ Anisomycin組Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF表達與模型組無明顯差異。由此可見，MAPK信號通路激活劑Anisomycin可逆轉miR-126 mimic對oxLDL處理的VSMC增殖和遷移的影響。上述結果表明，miR-126可通過抑制MAPK信號通路減弱oxLDL誘導的VSMC增殖和遷移。

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中會出現(xiàn)內皮細胞功能紊亂，平滑肌細胞增殖和遷移，炎性細胞招募，脂質和基質的積累以及血栓的形成[16]。針對這些變化，目前對于動脈粥樣硬化的治療策略主要包括生活方式的改變、降膽固醇降血壓藥物和抗血栓藥物以及外科手術治療，但是這些方法并非對所有的患者有效[17]。尋找開發(fā)新的治療方案具有重大意義。隨著分子生物學水平的提高，基因治療已經成為一種極具潛力的疾病治療手段。表達譜分析表明，在動脈粥樣硬化的病理背景下，許多miRNAs在內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞中都表達異常[18]。這揭示這些miRNAs可能在動脈粥樣硬化中起著重要作用，具有成為治療靶點的可能。

大量文獻報道了miRNAs在多種疾病中對細胞增殖具有重要的調控作用。在胰島瘤細胞中，miR-126可抑制葡萄糖引起的細胞增殖[19]。Yu等[20]發(fā)現(xiàn)miR-126上調表達會導致宮頸癌細胞增殖能力降低。miR-126還可調節(jié)類風濕性關節(jié)炎骨膜纖維母細胞增殖[21]。Schober等[22]發(fā)現(xiàn)miR-126可促進內皮增生并抑制動脈粥樣硬化病變。血管平滑肌細胞的增殖是動脈粥樣硬化的關鍵過程之一[23]。有數(shù)據(jù)表明oxLDL處理血管平滑肌細胞會導致miR-141表達降低，miR-141對血管平滑肌細胞增殖起著重要的調控作用[24]。Kim等[25]研究顯示過表達miR-365可降低血管平滑肌細胞增殖能力和增殖標記蛋白PCNA的表達。過表達miR-599可抑制血管平滑肌細胞增殖及增殖標記蛋白PCNA和Ki-67的表達[26]。與前人結果類似，本文結果顯示，50 mg/L的oxLDL處理人主動脈血管平滑肌細胞24 h會導致miR-126表達減弱，細胞增殖倍數(shù)及增殖標記蛋白表達升高；而miR-126 mimic則可以降低oxLDL誘導的細胞增殖倍數(shù)和增殖標記蛋白表達的增加。這說明，miR-126 mimic在可抑制oxLDL誘導的人主動脈血管平滑肌細胞T/G HAVSMC增殖能力的升高。

MiRNAs對多種疾病的細胞遷移也存在很大的影響。在結腸直腸癌中，增強miR-126表達可以抑制結腸直腸癌細胞遷移能力[27]。過表達miR-126還可抑制骨肉瘤細胞遷移[28]。Yang等[29]發(fā)現(xiàn)miR-126可抑制胃癌細胞遷移能力。血管平滑肌細胞是動脈管壁最豐富的細胞且與動脈粥樣硬化有關。據(jù)報道m(xù)iRNAs還可調控動脈粥樣硬化中平滑肌細胞的遷移[30]。有研究顯示miR-379可以抑制血管平滑肌細胞遷移[31]。過表達miR-145和miR-181b會導致血管平滑肌細胞遷移能力降低[32,33]。Cho等[34]發(fā)現(xiàn)miR-761可抑制血管緊縮素引起的血管平滑肌細胞遷移能力的增強。本研究結果顯示，oxLDL處理人主動脈血管平滑肌細胞后，細胞遷移及遷移標記蛋白表達增強；miR-126 mimic則可以抑制這種oxLDL誘導的細胞遷移及遷移標記蛋白表達的升高。這表明，增強miR-126表達可減弱oxLDL導致的人主動脈血管平滑肌細胞T/G HAVSMC遷移能力的升高。

眾所周知MAPK信號通路具有重要的生物學功能。據(jù)報道許多miRNAs是通過MAPK信號通路來發(fā)揮其功能。有研究表明過表達miR-126可通過調節(jié)ERK MAPK信號通路促進間質干細胞向內皮細胞分化[35]。Zuo等[36]發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化中，過表達內皮祖細胞的miR-26a會導致p-p38水平下降，p38表達水平無變化，這說明miR-26a可通過p38 MAPK途徑調控內皮祖細胞功能。有數(shù)據(jù)顯示在動脈粥樣硬化中miR-136可已通過ERK1/2 MAPK通路調節(jié)血管平滑肌細胞增殖[37]。Li等[38]發(fā)現(xiàn)miR-181b可通過調節(jié)p-ERK1/2/ERK1/2平衡來調控血管平滑肌細胞增殖。本文結果顯示，在oxLDL處理的VSMC中，MAPK信號通路中的p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK的相對蛋白表達量的比值升高，轉染miR-126 mimic可降低MAPK信號通路相關蛋白磷酸化水平的增加。而且，MAPK信號通路激活劑Anisomycin可逆轉miR-126 mimic對oxLDL處理的VSMC增殖和遷移的影響。上述結果表明，miR-126可通過MAPK信號通路調節(jié)人主動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移。

本研究表明，oxLDL處理人主動脈血管平滑肌細胞的模型中，細胞增殖和遷移能力提高，MAPK信號通路中的p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38、p-JNK/JNK比值升高。MiR-126 mimic可降低動脈粥樣硬化中細胞增殖和遷移能力及MAPK信號通路相關蛋白磷酸化水平的升高。MAPK信號通路激活劑Anisomycin可逆轉miR-126 mimic對oxLDL處理的VSMC增殖和遷移的影響。

綜上所述，miR-126可通過MAPK信號通路抑制oxLDL誘導的VSMC增殖和遷移。下一步計劃將通過動物模型對miR-126在動脈粥樣硬化中的作用進行體內研究，為開發(fā)新的動脈粥樣硬化治療方案奠定基礎。

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