詹慧芳 劉文娟 金 娟 龔建光 趙 黎 何 強(qiáng)

(浙江大學(xué)校醫(yī)院紫金港校區(qū)，杭州 310058)

足細(xì)胞(Podocyte)是一類位于腎小球毛細(xì)血管基底膜外側(cè)的臟層上皮細(xì)胞，因其胞漿在基底膜表面形成偽足樣突起而得名，足突之間的裂孔膜是腎小球?yàn)V過的最后一道屏障，因此足細(xì)胞的損傷將導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)。腎小球疾病發(fā)生過程中的許多因素都可能導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，使得腎小球血液濾過屏障被破壞，進(jìn)而推動腎小球疾病進(jìn)展直至終末期腎病。近年來，關(guān)于足細(xì)胞的研究成為腎小球疾病關(guān)注的熱點(diǎn)。大量的研究證實(shí)，自噬在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[1-3]。嘌呤霉素氨基核苷(Puromycin amino nucleoside，PAN)腎病模型是常用的足細(xì)胞損傷模型，有研究證實(shí)，雷帕霉素可以促進(jìn)Nephrin蛋白表達(dá)顯著增加，改善PAN所致的足細(xì)胞損傷，雷帕霉素還能減輕PAN腎病小鼠蛋白尿的程度[4,5]。然而足細(xì)胞自噬是否在雷帕霉素對PAN足細(xì)胞損傷模型的保護(hù)中發(fā)揮作用還不得而知。因此，本研究擬通過PAN足細(xì)胞損傷模型，觀察足細(xì)胞自噬改變，探尋雷帕霉素對足細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 雷帕霉素購于美國Selleck，RMPI-1640/DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone，重組的小鼠 γ-干擾素(IFN-γ)購于美國 Peprotech，AnnexinV/PI Apoptosis Detection Kit APC購于美國eBioscience，CCK-8試劑盒、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠LC3、p62.4EBP1、P70S6K、mTOR購自美國Proteintech，兔抗鼠P-4EBP1、P-P70S6K、P-mTOR購自美國Affinity，BCA蛋白定量試劑盒購于Thermos公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 小鼠永生化足細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，將細(xì)胞移入5 ml含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，1 200 r/min離心5 min，傾去含DMSO的上清；加入含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液5 ml，輕柔吹打至細(xì)胞呈單個，將其移入培養(yǎng)瓶；加入50 U/ml γ干擾素，放入33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長滿70%～80%時，用PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化后，加入RPMI1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。將含有50 U/ml γ干擾素的培養(yǎng)基換成不含有干擾素的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2 d更換一次培養(yǎng)液，待10～14 d足細(xì)胞即分化成熟，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組和操作。根據(jù)不同的處理分成對照組(Control組)，PAN組(加入50 μg/ml PAN)，雷帕霉素組(RAP組：分別加入100、200、300 ng/ml雷帕霉素)，PAN+雷帕霉素組(PAN+RAP組：細(xì)胞在用含PAN的培養(yǎng)液培養(yǎng)前1 h，分別用100、200、300 ng/ml雷帕霉素進(jìn)行預(yù)處理1 h)。

1.2.2CCK-8檢測足細(xì)胞生長 取對數(shù)生長期小鼠腎足細(xì)胞，胰蛋白酶消化，稀釋細(xì)胞使其濃度為(1～5)×105個細(xì)胞/ml，分別取100 μl至96孔板，33℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。按上述分組處理足細(xì)胞，給藥24 h后，按1∶10體積比混合Cell Counting Kit-8和無血清的RPMI1640，每孔100 μl加入待測孔，33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值。

1.2.3Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理同上，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液至合適離心管，PBS小心清洗細(xì)胞一次，加入適量胰酶消化細(xì)胞，室溫孵育后小心吸除胰酶，向離心管中加入細(xì)胞培養(yǎng)液小心吹散。1 000×g，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)；取(5～10)×104個重懸的細(xì)胞，1 000×g，離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-APC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-APC，輕輕混勻，4℃避光孵育15 min。加入5×PI染色液，輕輕混勻，4℃避光孵育5 min，同時以不加Annexin V-APC及PI的一管為陰性對照。流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-APC對應(yīng)BD流式細(xì)胞儀FL4檢測通道，PI對應(yīng)BD流式細(xì)胞儀FL2檢測通道。

1.2.4透射電鏡觀察自噬小體 各組細(xì)胞處理24 h 后，用細(xì)胞刮將玻片上的細(xì)胞刮下，將培養(yǎng)液離心，制備超薄切片后在透射電鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測LC3、p62、4EBP1、P70S6K、mTOR蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，充分裂解、離心后取上清，BCA法蛋白定量。蛋白樣品加入4×SDS loading buffer，沸水煮沸 5～10 min，離心。取 50 μg總蛋白加入SDS-PAGE凝膠上樣孔內(nèi)，電泳結(jié)束后，將NC膜在甲醇中浸泡，再使用Transfer Buffer浸泡凝膠、濾紙和NC膜，制備轉(zhuǎn)移三明治。轉(zhuǎn)膜完畢后，封閉，加一抗 4℃孵育過夜，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h。ECL 檢測樣本免疫活性凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測細(xì)胞生長 采用CCK-8試劑盒檢測各組小鼠足細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果如圖1所示，與對照組比較，PAN組的細(xì)胞生長受到顯著抑制(P<0.01)，100 ng/ml RAP對足細(xì)胞生長沒有明顯的抑制作用(P>0.05)，200 ng/ml RAP組的細(xì)胞受到顯著抑制(P<0.05)，300 ng/ml RAP組、PAN+100 ng/ml RAP組、PAN+200 ng/ml RAP組以及PAN+300 ng/ml RAP組的細(xì)胞增殖均受到顯著抑制(P<0.01)。與PAN組比較，PAN+100 ng/ml RAP組、PAN+200 ng/ml RAP組及PAN+300 ng/ml RAP組的細(xì)胞生長抑制作用得到顯著改善(P<0.01)。

2.2雷帕霉素抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡 采用Annexin V/PI雙染法檢測不同處理組小鼠腎足細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，PAN組、RAP組和PAN+RAP組細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<0.001)。與PAN組比較，RAP+PAN組細(xì)胞凋亡率顯著減少(P<0.001)。與RAP組比較，RAP+PAN組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.001)。見圖2A、B。

2.3雷帕霉素對PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬活性的影響 Western blot檢測各組小鼠足細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3和p62的表達(dá)。結(jié)果顯示，與 Control 組比較，PAN 組 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而p62蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；RAP 組 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。 與 PAN 組比較，PAN+RAP組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，見圖3A～C。透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體，如圖3D所示，Control組胞漿中可見較多自噬小體；PAN組胞漿內(nèi)可見較多空泡，自噬體明顯減少；RAP組胞漿內(nèi)可見大量空泡和自噬體；與PAN組比較，RAP+PAN組胞漿局部自噬體數(shù)量增加。

圖1 各組細(xì)胞增殖情況Fig.1 Proliferation of cells in each groupNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs Control group；#.P<0.05，##.P<0.01.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Flow cytometric dot plots of Annexin V and propidium iodide(PI) stainingNote: The concentration of puromycin amino nucleoside is 50 μg/ml.The concentration of rapamycin is 100 ng/ml.A.Flow cytometric dot plots of Annexin V and propidium iodide(PI)staining;B.Bar graph showed the percentage of cells apoptosis.***.P<0.001 vs control;###.P<0.001 vs PAN;△△△.P<0.001 vs PAN+RAP.

圖3 Western blot檢測各組小鼠足細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3和p62的表達(dá)及透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體(×20 000)Fig.3 Expression of LC3 and p62 protein detected by Western blot and autophagosomes(arrows)detected by transmission electron microscopy in podocytes of individual groups(×20 000)Note: A.Representative band of LC3 and p62 protein in individual groups;B and C.Bar graph showed the relative expression of LC3II and p62 protein;D.Autophagosomes(arrows) detected by transmission electron microscopy in the podocytes of individual groups.

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、P70S6K、p-P70S6K蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of mTOR，p-mTOR，4EBP1，p-4EBP1，P70S6K and p-P70S6K protein detected by Western blotNote: A.Representative band of mTOR，p-mTOR，4EBP1，p-4EBP1，P70S6K and p-P70S6K protein in individual groups;B.Bar graph showed the relative expression of p-mTOR/mTOR，p-4EBP1/4EBP1 and p-P70S6K/P70S6K.

2.4mTOR信號通路在雷帕霉素激活PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬活性中的作用 Western blot檢測各組細(xì)胞mTOR信號通路蛋白，結(jié)果如圖4A、B所示，與 Control 組比較，PAN 組 mTOR、 4EBP1、 P70S6K 磷酸化水平上調(diào)，RAP 組 mTOR、4EBP1、 P70S6K 磷酸化水平下調(diào)。 與 PAN 組比較，PAN+RAP 組 mTOR、 4EBP1、 P70S6K磷酸化水平下調(diào)。可見，mTOR、 4EBP1、 P70S6K 磷酸化水平與足細(xì)胞自噬活性成負(fù)相關(guān)。

3 討論

自噬(Autophagy)是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)蛋白再循環(huán)機(jī)制，它能導(dǎo)致不同于凋亡的不依賴于caspase途徑的程序性細(xì)胞死亡。自噬廣泛存在于正常的生理過程中，維護(hù)著細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬可使細(xì)胞應(yīng)對各種細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)激，然而過度的自噬或自噬不足，均可對機(jī)體造成損害。許多的腎小球疾病如膜性腎病[2]、糖尿病腎病[6]、局灶節(jié)段腎小球硬化癥[7]等都表現(xiàn)為足細(xì)胞自噬活性的下調(diào)。我們的結(jié)果顯示PAN處理足細(xì)胞24 h后，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ明顯下調(diào)，而p62蛋白出現(xiàn)堆積而上調(diào)，表明自噬受到抑制；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率顯著下降，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[8]。

雷帕霉素是一種新型的免疫抑制劑,是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin mTOR)信號通路特異性的負(fù)調(diào)控因子。mTOR屬于磷酸肌醇3激酶超家族成員，是平衡細(xì)胞生長和自噬通路中的重要調(diào)節(jié)因子，起著應(yīng)對胞內(nèi)各種生理反應(yīng)和外部環(huán)境壓力的作用[9]。我們發(fā)現(xiàn)100 ng/ml 的雷帕霉素對正常足細(xì)胞不會出現(xiàn)抑制，但可以顯著抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。雷帕霉素預(yù)處理后，PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率由原來的38.5%下降為24.1%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與PAN處理相比，雷帕霉素可以顯著提升足細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)，同時降低p62蛋白的水平，可見自噬水平得到激活。同樣，透射電鏡的結(jié)果顯示雷帕霉素促進(jìn)自噬小體的形成，自噬活性得到提升。激活自噬后，細(xì)胞將暫停合成功能并降解損傷細(xì)胞器及相關(guān)蛋白(包括損傷線粒體及 caspase 酶等)，為細(xì)胞生存及修復(fù)提供能量和原料，減輕細(xì)胞損傷程度，從而延緩凋亡發(fā)生[10]。

另外，起始因子 4E 結(jié)合蛋白(eukaryotic initiat-ion factor 4E binding protein 1，4EBP1)和核糖體40S小亞基S6蛋白激酶(70-kD ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)是mTOR通路下游的兩種靶蛋白，正常生理條件下，mTOR處于活化狀態(tài)，不僅可以磷酸化下游 Atg 蛋白直接抑制自噬激活，還可以磷酸化真核細(xì)胞4EBP1及 p70S6K進(jìn)而抑制自噬[11,12]。當(dāng)mTOR的活性被抑制，4EBP1及 p70S6K的磷酸化將受到抑制，4EBPl與eIF4E 親和力升高，S6K磷酸化水平下降，翻譯起始復(fù)合物形成被抑制，翻譯效率下降和限制細(xì)胞增殖[13,14]。我們的研究表明，PAN可以促進(jìn)mTOR、4EBP1及p70S6K的磷酸化，而雷帕霉素可以抑制mTOR、4EBP1及p70S6K活化，說明雷帕霉素可能通過靶向抑制mTOR信號通路的活化來促進(jìn)自噬的激活，從而達(dá)到足細(xì)胞的保護(hù)作用。

總之，我們的研究顯示，雷帕霉素可通過激活自噬改善PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，mTOR/4EBP1、P70S6K信號通路在自噬活化中可能起到重要作用，這對進(jìn)一步了解雷帕霉素對足細(xì)胞保護(hù)作用具有重要意義。

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