趙洪偉 崔銀鋒 姜京植 車 楠 葉 晶 王重陽 李良昌

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延吉 133002)

肥大細(xì)胞是哮喘、變應(yīng)性鼻炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病的主要效應(yīng)細(xì)胞，來源于骨髓造血干細(xì)胞并能遷移到皮膚和呼吸道等內(nèi)臟黏膜下微小血管的周圍完成分化和成熟。抗原和免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)交聯(lián)激活肥大細(xì)胞表面的IgE高親和力受體(High-affinity immunoglobulin E receptor Fc epsilon RI)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Src家族酪氨酸激酶活化，激活蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)，絲裂原活化蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)，最終導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化釋放組胺、TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)，在免疫性疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[1]。芝麻素是從芝麻油中提取出來的一種木脂素類化合物。近年來研究表明芝麻素可以抑制人單核細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，減輕抗原誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥，同時(shí)也可以通過抑制TLR4信號(hào)減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[2-4]。芝麻素表現(xiàn)出明顯的抗炎作用，但其對(duì)肥大細(xì)胞FcεRI受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響缺少相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)人肥大細(xì)胞系HMC-1細(xì)胞，利用anti-dinitrophenyl (DNP) IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化，觀察芝麻素對(duì)肥大細(xì)胞FcεRI受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，并對(duì)其影響肥大細(xì)胞脫顆粒和炎癥介質(zhì)釋放的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 芝麻素、anti-DNP IgE、DNP-human serum albumin (HSA)、HEPES、β-actin抗體購自Sigma公司；抗Lyn、Syk、PKCα、IκB和磷酸化抗體，NF-κB p65和PARP抗體購自Santa Cruz公司；TNF-α、IL-6和IL-1β的ELISA試劑盒購自R&D公司;IL-8和組胺ELISA試劑盒購置默沙克公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HMC-1細(xì)胞購自美國ATCC公司，在含有10%熱滅活胎小牛血清，100 U/ml 青霉素鈉和100 μg/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，5%CO2和37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分成5組，對(duì)照組(Control)細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)，模型組(Model)細(xì)胞用10 μg/ml的 anti-DNP IgE處理6 h后再用100 ng/ml的DNP-HAS孵育10 min誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞脫顆粒。芝麻素低(Sesamin 25)、中(Sesamin 50)、高(Sesamin 100)濃度組處理同模型組，但在DNP-HAS處理前給予最終濃度25、50和100 μg/L芝麻素預(yù)處理30 min。

1.2.2細(xì)胞毒性試驗(yàn) 利用MTT方法檢測(cè)芝麻素對(duì)肥大細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。將HMC-1細(xì)胞稀釋濃度為1×106細(xì)胞/ml懸液，取懸液200 μl以后，并加入不同濃度芝麻素(最終濃度25、50和100 μg/L)，37℃水浴箱中孵育2 h，洗凈，然后加MTT 20 μl，在 37℃水浴箱中孵育1 h，形成紫色晶體，用DMSO去除多余的MTT在570 nm測(cè)量吸光度。

1.2.3肥大細(xì)胞脫顆粒率及炎癥介質(zhì)濃度測(cè)定 anti-DNP IgE致敏細(xì)胞后，加入25、50和100 μg/L芝麻素預(yù)處理30 min，然后DNP-HAS誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，顯微鏡下任選10個(gè)視野計(jì)數(shù)脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)目，肥大細(xì)胞脫顆粒率(%)=(脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù))×100%。脫顆粒的細(xì)胞離心取適量上清液，按試劑盒操作步驟分別測(cè)定組胺和各細(xì)胞因子濃度。

1.2.4核蛋白萃取 參照我們以前方法[5]，細(xì)胞破碎后放入2倍體積的富含1.3 mol/L蔗糖,1.0 mol/L MgCl2，pH7.2的10 mmol/L PBS緩沖液,4℃，1 000 r/min離心15 min，沉淀再懸浮于富含2.2 mol/L蔗糖,1.0 mmol/L MgCl2，pH7.2的10 mmol/L PBS緩沖液中，100 000 r/min離心1 h，獲得的細(xì)胞核在0.25 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L MgCl2和pH7.2，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中清洗，然后1 000 r/min離心10 min，所得沉淀在含有50 mmol/L Tris-HCl (pH7.2),0.3 mmol/L蔗糖,150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,20%甘油,2% Triton X-100,2 mmol/L PMSF和蛋白酶抑制劑混合物中裂解，冰浴1 h后12 000 r/min離心30 min，收集上清液作為可溶性核蛋白進(jìn)行分析。

1.2.5免疫印跡 收集細(xì)胞進(jìn)行裂解獲取蛋白，BCA方法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)泳道加樣30 μg總蛋白，10%SDS-PAGE膠120 V，90 min進(jìn)行蛋白分離，分離的蛋白250 mA，90 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液孵育1 h封閉膜上非特異性位點(diǎn)，分別加入相應(yīng)的稀釋抗體4℃ 過夜。第2天，洗膜后再用HRP標(biāo)記的二抗雜交，37℃ 孵育1 h。洗膜后加ECL發(fā)光試劑，利用Gel Doc進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測(cè)結(jié)果 給予25、50和100 μg/L的芝麻素處理HMC-1細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)濃度的芝麻素對(duì)HMC-1的活性無影響，見表1。

GroupsConcentration(μg/L)ODMastcelldegranulation(%)Histamine(μg/ml)Control-1 12±0 131 34±0 180 11±0 01Model--82 34±4 231)1 16±0 101)Sesamin25251 21±0 1672 36±3 860 95±0 11Sesamin50501 18±0 1542 16±3 962)0 72±0 152)Sesamin1001001 24±0 1832 58±2 752)0 59±0 082)

Note：Vs control group,1)P<0.05;vs model group,2)P<0.05.

2.2芝麻素對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒率和組胺釋放的影響 模型組肥大細(xì)胞脫顆粒和組胺釋放明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芝麻素能明顯降低肥大細(xì)胞脫顆粒率和組胺的釋放，中、高 (50、100 μg/L)濃度組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3芝麻素對(duì)HMC-1細(xì)胞因子釋放的影響 肥大細(xì)胞能分泌TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-8等多種細(xì)胞因子，模型組DNP-HSA誘導(dǎo)致敏的肥大細(xì)胞活化后能明顯提高這些細(xì)胞因子的釋放，與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予不同濃度的芝麻素預(yù)處理后能降低細(xì)胞因子的釋放，芝麻素中、高濃度組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖1 芝麻素對(duì)Lyn和Syk活化的影響Fig.1 Effect of sesamin on activation of Lyn and Syk in HMC-1 cellsNote: Vs control group，#.P<0.05；vs model group，*.P<0.05.

2.4芝麻素對(duì)Lyn和Syk活化的影響 Lyn和Syk是肥大細(xì)胞FcεRI受體的下游信號(hào)分子，模型組DNP-HAS與anti-DNP IgE結(jié)合后活化FcεRI受體，Lyn和Syk磷酸化水平增高，與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予不同濃度的芝麻素預(yù)處理后能降低Lyn和Syk磷酸化水平，芝麻素中、高濃度組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.5芝麻素對(duì)PKCα活化的影響 模型組PKCα磷酸化水平明顯升高，與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芝麻素能減低PKCα磷酸化水平，芝麻素中、高濃度組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.6芝麻素對(duì)IκBα磷酸化的影響 模型組IκBα磷酸化明顯升高，磷酸化的IκBα隨后降解，總IκBα表現(xiàn)為下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芝麻素中、高濃度組能明顯降低IκBα磷酸化，提高總IκBα，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。提示芝麻素能抑制IκBα磷酸化和降解。

圖2 芝麻素對(duì)PKCα活化的影響Fig.2 Effect of sesamin on activation of PKCα in HMC-1 cellsNote: Vs control group，#.P<0.05；vs model group,*.P<0.05.

GroupsConcentration(μg/L)TNF?α(pg/ml)IL?6(ng/ml)IL?1β(ng/ml)IL?8(ng/ml)Control-21 23±2 688 23±0 983 68±0 560 38±0 01Model-76 56±5 231)31 26±2 311)22 56±1 821)1 52±0 091)Sesamin252568 25±3 9228 51±3 1219 21±1 631 34±0 08Sesamin505048 51±3 652)18 14±2 102)9 68±1 462)0 76±0 052)Sesamin10010039 41±2 192)15 23±1 822)6 23±1 622)0 52±0 052)

Note：Vs control group,1)P<0.05;vs model group,2)P<0.05.

圖3 芝麻素對(duì)IκBα磷酸化的影響Fig.3 Effect of sesamin on phosphorylation of IκBα in HMC-1 cellsNote: Vs control group，#.P<0.05；vs model group，*.P<0.05.

2.7芝麻素對(duì)NF-κB活化的影響 模型組細(xì)胞漿內(nèi)NF-κB p65明顯減少而細(xì)胞核內(nèi)明顯增多，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芝麻素中、高濃度組能明顯提高細(xì)胞漿并減少細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。提示芝麻素能減少NF-κB p65從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。

3 討論

肥大細(xì)胞是變態(tài)反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)入機(jī)體的抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別產(chǎn)生相應(yīng)的IgE抗體，IgE抗體與肥大細(xì)胞表面受體FcεRI結(jié)合使細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體再次接觸同一抗原后可以活化肥大細(xì)胞，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，導(dǎo)致組胺的釋放。組胺是肥大細(xì)胞釋放一種重要炎癥介質(zhì)，能夠提高局部血流量，增加血管的通透性，引起組織腫脹和瘙癢，參與變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生[6]。O′Mahony等[7]報(bào)道，組胺的作用效果依賴于組胺受體亞型的表達(dá)，降低組胺的釋放量將會(huì)有效的抑制組胺介導(dǎo)的病理反應(yīng)的發(fā)生。肥大細(xì)胞也能合成和釋放TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等多種炎癥細(xì)胞因子，TNF-α是一種內(nèi)源性致熱源能導(dǎo)致機(jī)體體溫升高，并能誘導(dǎo)IL-6和IL-1β產(chǎn)生，刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放一氧化氮和氧自由基等炎癥介質(zhì)。IL-6參與急性炎癥反應(yīng)，IL-1β 和IL-8能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮表達(dá)黏附因子，促使炎癥細(xì)胞浸潤和活化。近年來針對(duì)這些細(xì)胞因子的中和抗體，可溶性受體和受體拮抗劑在治療炎癥性疾病取得良好的療效[8,9]。由此可見，抑制組胺和炎癥細(xì)胞因子的釋放能有效地控制肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。以此為研究中心，國內(nèi)學(xué)者利用藥用植物的有效成分如木犀草素和資木瓜中莽草酸抑制肥大細(xì)胞活化并有效的控制炎癥反應(yīng)[10,11]。本實(shí)驗(yàn)選擇具有抗炎作用的芝麻素為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)芝麻素對(duì)HMC-1細(xì)胞無毒性作用，能夠抑制抗原抗體反應(yīng)誘導(dǎo)HMC-1細(xì)胞脫顆粒，同時(shí)降低組胺和TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等炎癥細(xì)胞因子釋放。

圖4 芝麻素對(duì)NF-κB活化的影響Fig.4 Effect of sesamin on activation of NF-κB in HMC-1 cellsNote: Vs control group，#.P<0.05；vs model group，*.P<0.05.

肥大細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子與FcεRI受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，F(xiàn)cεRI受體激活后通過Src家族激酶的Lyn磷酸化FcεRI受體的和鏈的免疫受體酪氨酸激活基序(Immune tyrosine activation motif，ITAM)，磷酸化的ITAM暴露Src同源2(Src Homology 2，SH2)區(qū)域的錨點(diǎn)部位，隨后酪氨酸蛋白激酶Syk被招募到磷酸化的ITAM的SH2錨點(diǎn)部位。本實(shí)驗(yàn)觀察到anti-DNP IgE致敏肥大細(xì)胞后利用抗原DNP-HAS能迅速激活FcεRI受體，導(dǎo)致下游信號(hào)Lyn和Syk磷酸化，但兩者的磷酸化都被芝麻素明顯抑制，暗示芝麻素能夠抑制肥大細(xì)胞FcεRI受體激活后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。肥大細(xì)胞FcεRI受體激活介導(dǎo)了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Syk是一個(gè)重要因子。Law等[12]發(fā)現(xiàn)磷脂酶Cα(PLCα)可以與Syk的酪氨酸殘基連接并成為其作用底物，Lu等[13]等研究發(fā)現(xiàn)三白草提取物通過抑制Syk磷酸化和下游PLCα介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流減輕肥大細(xì)胞脫顆粒。這可能是芝麻素抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的原因之一。近年來研究表明激活的Syk能夠磷酸化PLCα導(dǎo)致PKC信號(hào)通路激活[14,15]。激活的PKC可以選擇性控制IκB激酶復(fù)合物激活，隨后IκBα磷酸化，磷酸化的IκBα通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解，NF-κB從與其抑制性蛋白IκB形成的復(fù)合物中釋放進(jìn)入細(xì)胞核，激活NF-κB與DNA上特異性序列結(jié)合引起包括TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等目的基因的轉(zhuǎn)錄，PKC信號(hào)介導(dǎo)的NF-κB激活在炎癥疾病中發(fā)揮重要的作用。Kim等[16]研究發(fā)現(xiàn)PKC/NF-κB途徑激活明顯提高氣道上皮細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的mRNA水平，siRNA干擾PKCα后能明顯降低這些因子的表達(dá)，Song等[17]研究發(fā)現(xiàn)PKCα通過磷酸化IκBα激活NF-κB介導(dǎo)氣道變態(tài)反應(yīng)性疾病，隨后Zheng等[18]發(fā)現(xiàn)PKCα和NF-κB的表達(dá)存在著正相關(guān)，并且PKCα選擇性抑制劑G?6976能阻斷佛波酯誘導(dǎo)的PKCα和NF-κB的激活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明激活的肥大細(xì)胞通過PKCα磷酸化IκBα，最終導(dǎo)致NF-κB活化。芝麻素對(duì)PKCα NF-κB信號(hào)途徑有明顯的抑制作用，綜上所述，我們認(rèn)為芝麻素有明顯的抑制肥大細(xì)胞活化作用，它可以作用于肥大細(xì)胞表面FcεRI受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并通過抑制PKCα/NF-κB途徑降低炎癥介質(zhì)釋放。

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