周曉雅 周 祺 殷冬冬 唐井玉 邢 雪 董 靖 劉紅梅 王桂軍

(安徽農業(yè)大學動物科技學院，獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室，合肥 230036)

1987年，Johnstone等[1]發(fā)現體外培養(yǎng)的成熟綿羊紅細胞分泌囊泡，并提出產生胞外體(Exosome)的說法。Johnstone等[1]還指出，在綿羊紅細胞的成熟階段，胞外體通過釋放一些不必要的膜蛋白來調節(jié)晚期膜運動。幾乎所有細胞均可分泌胞外體[2-4]。胞外體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，體內分泌的胞外體可以從血液、尿液和唾液中提取分離。胞外體富含熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、四次跨膜蛋白家族(CD9、CD63、CD81)、內吞體分選轉運復合體等物質[2-4]。胞外體內還富含mRNAs、miRNAs以及其他ncRNAs[5]。胞外體由于其特殊的組成結構，可通過調節(jié)特異性的蛋白、核酸、脂質等的分泌，參與機體內多種生理或病理反應。

鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬，是單股正鏈RNA病毒。該病毒有囊膜，表面有纖突，主要在感染細胞的胞漿內復制，病毒大小在40～60 nm之間，病毒基因組僅含有一個開放閱讀框，共編碼3種結構蛋白(C、prM/M和E)和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[6-11]。該病毒主要感染鴨子，發(fā)病率高，傳染性強。該病在全國多地均有報道，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經濟損失[12]。同屬于黃病毒科的病毒還有丙型肝炎病毒、豬瘟病毒、登革熱病毒。近年來的研究表明，感染人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、登革熱病毒的細胞分泌的胞外體會攜帶病毒的RNA和蛋白質，以及宿主細胞的功能蛋白質或者RNA來參與感染和免疫應答[13]。而相對于其他黃病毒科病毒，鴨坦布蘇病毒的相關研究甚少，胞外體在病毒感染及免疫機制中扮演什么角色仍是未知。本實驗主要探究鴨坦布蘇病毒感染細胞后，外泌體在粒徑及蛋白組分上的差異，并為進一步了解該病毒感染機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和病毒來源 BHK-21細胞購自中國科學院上海細胞庫，由獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存。鴨坦布蘇病毒AH-F10株由本實驗室分離并保存。

1.1.2主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，胎牛血清(FBS)購自康源生物，0.25%胰蛋白酶和ECL顯色液購自Beyotime公司，0.01 mol/L PBS(Phosphate-buffered saline自制)，PEG6000購自Biosharp公司，CD9和CD63單抗購自Abcam公司，羊抗鼠HRP抗體購自Solarbio公司，0.22 μm濾器購自Millex公司，透射電鏡購自日立公司，高速冷凍離心機購自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將凍存于液氮中的BHK-21細胞復蘇后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)3代。

1.2.2病毒處理 利用鴨坦布蘇病毒感染BHK-21細胞，用含1%胎牛血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，PBS清洗3次，去除細胞上清，細胞經3次反復凍融，3 000×g離心15 min，獲得的病毒感染細胞裂解液離心上清置于-80℃保存，用于后期細胞感染，制備病毒感染細胞胞外體。

1.2.3細胞上清制備 待BHK-21細胞生長密度達80%～90%，棄去培養(yǎng)基上清，用PBS洗滌兩次，用已預溫37℃的不含FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，試驗組(A組)加入1.2.2中制備的細胞上清鴨坦布蘇病毒液300 μl(75 cm2培養(yǎng)瓶)，37℃，5%CO2，孵化箱孵育2 h。對照組(B組)用不含FBS的DMEM培養(yǎng)基孵育2 h后棄液，用預溫的DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，再加入不含FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)40 h后，收集上清液于EP管中，同時設置一組正常感染組(C組)，添加1%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)40 h。

1.2.4病毒增殖的檢測 分別取上述3組培養(yǎng)40 h 的細胞上清按照Trizol 說明書提取上清總RNA，取10 μl RNA，10 mmol/L dNTPs 3 μl，10 μmol/L下游引物1 μl，置70℃水浴5 min，冰浴2 min；加入M-MLV 1 μl，Buffer 5 μl，反應條件為42℃ 50 min，95℃ 5 min，產物置-20℃?zhèn)溆?。針對鴨坦布蘇病毒NS基因設計一對特異性引物，上游引物：AGA CTG CTG GTG CAA TGA GAC，下游引物：CGT CGT TCC CAG ATT CCA，目的片段長度為260 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板，擴增NS基因，PCR反應體系為 25 μl：2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板2 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反應條件：94℃預變性 5 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃總延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后進行觀察。

1.2.5胞外體的提取 收集的細胞上清4℃下3 000×g離心30 min，棄沉淀，去除細胞及細胞碎片；再將上清10 000×g 4℃離心30 min棄沉淀；加入1/5上清體積量的 40%PEG6000，混勻置于4℃ 孵育過夜。4℃下10 000×g離心50 min。棄去上清，底部沉淀用0.01 mol/L PBS重懸，經0.22 μm濾器過濾，再次4℃下10 000×g離心50 min，沉淀用少量PBS重懸，置于-80℃保存。

1.2.6胞外體蛋白含量測定 取2 μl胞外體重懸液進行Biodrop微量蛋白核酸測量儀校正，將2 μl胞外體重懸液加樣于測量孔中進行蛋白含量測定，重復3次取平均值。測完一個樣本后用PBS洗3次后再測其他樣品。

1.2.7胞外體透射電鏡觀察 將銅網置于濾紙上，吸取10 μl的胞外體懸液在銅網上，室溫烘干5 min左右，滴加10 μl 3%的磷鎢酸溶液滴于銅網上，室溫負染5 min。80KV透射電鏡觀察。

1.2.8胞外體SDS-PAGE及標記分子Western blot鑒定 分別取試驗組(A組)及對照組(B組)的細胞胞外體懸浮液10 μg加5×上樣緩沖液，煮沸10 min，冰上放置5 min；經10%的SDS-PAGE膠電泳分離(濃縮膠70 V電泳30 min，分離膠120 V電泳70 min)；轉移蛋白膠于0.45 μm的PVDF膜上(按PVDF膜面積1.5 mA/cm2電轉45 min)；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌5 min，一抗稀釋液為含5%脫脂奶粉的TBST，一抗為外泌體標志分子抗體anti-CD63(1∶1 000稀釋)、anti-CD9(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗用TBST以1∶5 000稀釋，室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，進行ECL顯影。

1.2.9質譜鑒定 兩組各取10 μg 胞外體重懸液(去離子水重懸)，進行SDS-PAGE電泳。利用考馬斯亮藍染色，脫色，對整條電泳跑道切膠進行質譜分析。每組設3個重復送樣至中國科學技術大學生命科學學院公共平臺進行質譜鑒定。

1.3統(tǒng)計學方法 胞外體粒徑大小分析，隨機測量50個胞外體的直徑，每組取3張不同視野的電鏡圖片進行重復測距。利用GraphPad Prism6軟件對統(tǒng)計數據進行t檢驗分析。

2 結果

2.1BHK-21細胞培養(yǎng)狀態(tài)及病毒RT-PCR檢測 試驗組(A組)、對照組(B組)及正常感染組(C組)細胞培養(yǎng)40 h后細胞生長良好，細胞活性較好，細胞排列緊密，胞核清晰胞漿均勻，沒有明顯分化現象。從3組細胞上清中均未檢測到鴨坦布蘇病毒核酸。

2.2蛋白含量測定結果 利用8%PEG6000提取細胞上清胞外體，經微量蛋白核酸測量儀測定，感染病毒組(A組、C組)胞外體蛋白含量為528.2 μg/ml，對照組(B組)胞外體蛋白含量為474.8 μg/ml，見圖1。

圖1 BHK-21細胞培養(yǎng)上清病毒NS基因的RT-PCR檢測Fig.1 RT-PCR was used to detect expression of NS in cell supernatantNote: M.Marker;1.Positive control;2.Infected group;3.Normal group;4.Uninfected control group.

2.3電鏡觀察 將上述制備的細胞上清胞外體，通過電鏡觀察，電鏡背景清晰，且未發(fā)現病毒顆粒，直徑在30～160 nm，與文獻報道相一致，見圖2。

2.4胞外體直徑比較 通過電鏡觀察，利用Photoshop軟件測距功能測定胞外體的直徑大小。統(tǒng)計結果：試驗組胞外體直徑大小為(71.74±28.33)nm；對照組胞外體直徑大小為(58.97±17.34)nm。兩組數據進行T檢驗，P=0.026 9<0.05，兩組胞外體直徑大小差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

圖2 感染組(A)和對照組(B)胞外體電鏡圖Fig.2 TEM of exosome from infected group (A) and unfected group (B)

圖3 試驗組(A)和對照組(B)SDS-PAGE重復電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of infected group(A) and uninfected group(B)

圖4 對照組(A)和感染組(B)上清胞外體CD63和CD9標志分子鑒定Fig.4 Identification of exosome CD63 and CD9 molecular by Western blot from infected group(A) and uninfected group(B)

2.5胞外體的SDS-PAGE及標志分子鑒定 將試驗組細胞胞外體及對照組細胞胞外體進行SDS-PAGE電泳，病毒感染的試驗組和未感染對照組蛋白條帶分布有明顯差異(圖3)。應用胞外體標志分子(CD63、CD9)對胞外體進行Western blot鑒定，結果顯示，試驗組和對照組胞外體均檢測到CD63和CD9標志分子(圖4)。

表1胞外體質譜鑒定蛋白數統(tǒng)計表

Tab.1Quantitystatisticsofexosomebymassspectrometry

GroupsTotalnumberofproteinCommonproteinDifferentproteinExoCartaTreatment84275779Control49272240

圖5 試驗組及對照組胞外體蛋白種類同ExoCarta數據庫的比較韋恩圖Fig.5 Venn diagram of type treatment group and control group exosome protein type comparison with ExoCarta database

2.7胞外體液相質譜分析 應用液相質譜對胞外體蛋白質分子鑒定和種類統(tǒng)計，肽段序列經MASCOT數據庫檢索，獲得蛋白鑒定信息。蛋白被成功鑒定標準為一、二兩級質譜綜合得分均大于60且可信度大于95%。結果鑒定出試驗組及對照組共106種蛋白，試驗組檢測出84種蛋白，對照組49種蛋白(表1)。利用TBtools對質譜結果同數據庫比對的結果，制作韋恩圖，其中相同蛋白27種，試驗組專有蛋白57種，對照組專有蛋白22種(圖5)。經ExoCarta蛋白數據庫比對，其中有92種蛋白質在ExoCarta數據庫中可檢索出，13種蛋白質該數據庫中沒有記錄(表2)。

3 討論

3.1胞外體的提取 提取胞外體的常用方法是梯度離心，離心力需高達100 000×g，提取繁瑣[12,13]。ExoQuickTM(SBI)和Total Exosome Isolation(Life Technologies)試劑是現如今提取胞外體使用度較高的兩種試劑，這兩種試劑只需要低速離心，步驟簡單，但價格昂貴。

表2胞外體蛋白質譜分析結果

Tab.2Massspectrometryassayofexosomes

ProteinGeneNumberofsignificantsequencesExoCartaNoteFibronectin?MusmusculusFn125√CommonproteinComplementC3?RattusnorvegicusC314√CommonproteinTypeⅠcytoskeletal19?RattusnorvegicusKrt191√CommonproteinTypeⅡcytoskeletal5?MusmusculusKrt51√CommonproteinTypeⅡcytoskeletal2?MusmusculusKrt21√CommonproteinOlfactomedin?likeprotein3?MusmusculusOlfml36√OnlythetreatmentMajorvaultprotein?MusmusculusMvp5√OnlythetreatmentHeatshock?related70kDprotein2?MusmusculusHspa22√OnlythetreatmentExtracellularmatrixprotein1?MusmusculusEcm11√OnlythetreatmentHeatshockproteinHSP90?alpha?Musmusculushsp90aa11√OnlythetreatmentFibulin?1?MusmusculusFbln12√OnlythecontrolKeratin，typeⅡcytoskeletal4?MusmusculusKrt41√OnlythecontrolGelsolin?MusmusculusGsn2√OnlythecontrolComplementfactorB?RattusnorvegicusCfv1√OnlythecontrolAlpha?2?macroglobulin?RattusnorvegicusA2m1√Onlythecontrol

利用PEG富集沉淀病毒的歷史已經超過50年。由于胞外體與病毒存在相似的生物學特性[14]。借鑒Mahy和Kangro利用PEG富集病毒的方法，提取胞外體[15]。上述實驗結果進一步證實，使用PEG提取胞外體，可達到富集及進一步純化的目的。由于鴨坦布蘇病毒粒子呈球形， 直徑 45～60 nm[6，7]，與胞外體粒徑大小相似， 因此上清中不能有病毒干擾，故通過RT-PCR檢測DTMUV是否釋放，最終確定無血清培養(yǎng)時間為40 h。采用病毒的細胞裂解液作為胞外體后續(xù)試驗的病毒來源，一方面避免了病毒尿囊液中胞外體的影響，也避免了細胞感染病毒過程中自我分泌于胞外上清中的胞外體的影響。

3.2病毒感染與細胞胞外體 近年來，關于病毒感染細胞產生胞外體的研究逐漸增多，很多研究表明，感染病毒的細胞分泌的胞外體會攜帶病毒的蛋白或者RNA并參與病毒的感染過程[13]。人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)造成患者持續(xù)性感染的可能原因是由于從患者血清中分離的胞外體含有HIV中反式激活元件(Transactivating response，TAR)的RNA[16]。鴨坦布蘇病毒如何侵入細胞，進入細胞后發(fā)生的一系列的生物合成過程及病毒粒子的釋放機理尚不清楚。由于胞外體形成的過程復雜，其成分亦復雜，且不同細胞分泌的胞外體所攜帶物質也會不同[2,3]。本研究提取感染組的細胞上清胞外體，未檢測出病毒核酸和病毒蛋白，由于體外實驗中采用的細胞為非鴨源細胞，鴨坦布蘇病毒感染宿主細胞是否影響胞外體的分泌有待進一步探究。

3.3胞外體質譜結果的分析 本研究應用質譜法檢測出的胞外體蛋白種類同ExoCarta數據庫比對，蛋白率吻合高，進一步佐證了用PEG可以有效提取細胞上清中的胞外體。其中試驗組與對照組共同擁有的蛋白質有27種，包括大量的骨架蛋白(Krt2、Krt5、Krt19、Krt73等)、補體(C3、C4、C7等)、纖維蛋白，在ExoCarta數據庫中可檢索到，這些蛋白同樣可以在動物生理及病理過程中發(fā)揮重要的作用。釋放于胞外環(huán)境的胞外體主要通過黏附作用于靶細胞，并被細胞內吞傳遞信號分子。纖連蛋白(Fibronectin，Fn)是一種細胞糖蛋白，存在于胞外環(huán)境和細胞表面，具有多種生物活性。有研究發(fā)現，骨髓瘤細胞和骨髓瘤患者血清中的胞外體含有纖連蛋白，該蛋白是胞外體作用靶細胞的配體，并調節(jié)細胞間的相互作用[17]。有研究利用E.coli將丙型肝炎病毒的非機構蛋白NS3蛋白同Fn的結構域A進行融合并純化，該融合蛋白免疫小鼠可激活樹突狀細胞的成熟，同時提高免疫細胞抗原呈遞能力，該融合蛋白為丙型肝炎病毒新型疫苗的開發(fā)奠定基礎[18]。試驗組檢測出57種不同的蛋白，含硫酸類肝素多糖蛋白(HSPG)、過氧蛋白(Olfml3)、穹窿體主蛋白(Major vault protein，MVP)、白細胞介素(IL)等。目前為止，鴨坦布蘇病毒同上述蛋白間的作用關系的研究甚少。HSPG僅存在于細胞的表面和胞外中，作為細胞表面受體或共受體，已有證實丙型肝炎病毒感染細胞時，HSPG對丙型肝炎病毒侵入細胞及病毒增殖均有影響，該病毒感染肝癌細胞通過激活NF-KappaB通路，使SMAD6、SMAD7表達上調，進一步使細胞HSPG的表達量增多，進一步實驗證明，HSPG表達上調，可促進HCV侵入細胞，并促進病毒增殖[19]。與HSPG受體相關的配體有白細胞介素、干擾素、整合素等，很多研究表明，黃病毒科中西尼羅病毒、日本腦炎病毒和丙型肝炎病毒都能誘導白細胞介素的釋放[20,21]。肝細胞白細胞介素水平的升高是丙型肝炎病毒感染炎癥期的主要特征[21]。MVP蛋白是一種新型的病毒誘導宿主因子，并可影響Ⅰ型干擾素的釋放，引發(fā)細胞的抗病毒反應[22，23]。熱休克蛋白 90α(Heat shock protein 90α，HSP90α)和熱休克蛋白70(HSP70)是細胞受應激原刺激后誘導產生的應激蛋白，作為一種腫瘤標志物并應用于多種腫瘤病的臨床檢測[24,25]。HSP70在癌癥、傳染病等相關領域也是研究熱點。結核桿菌的HSP70具有分子佐劑和載體效應，可誘導和增強機體的體液免疫和細胞免疫。將HSP70同流行性乙型腦炎病毒E蛋白進行融合，制備的基因工程疫苗可讓小鼠產生更好的中和抗體水平，該基因工程疫苗效果優(yōu)于弱毒苗[26]。控制及預防傳染病的主要方式是疫苗接種，利用病毒某單一蛋白同其他配體或受體蛋白結合為病毒疫苗的研制提供了新的研究方向，在了解病毒致病機制的同時也奠定了新型疫苗研制的基礎。

近年來胞外體一直是研究熱點，利用蛋白質組學及其他生物信息學方法為細胞胞外體的研究提供了很大的便利。本研究通過提取感染病毒的細胞上清中的胞外體并對其進行質譜鑒定，綜合其他黃病毒科病毒的研究基礎，為鴨坦布蘇病毒感染及致病機理研究奠定了基礎。

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