金京順，焦淑婷，張楓燃，李海峰★

（1.吉林省延吉市動物疫病預防控制中心，吉林 延吉 133002；2.延邊大學農學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉 133002）

大腸桿菌是引起豬腹瀉的主要致病菌之一，可引起不同年齡段的豬發(fā)生仔豬黃痢、仔豬白痢及豬大腸桿菌病，豬大腸桿菌病是影響?zhàn)B豬企業(yè)的重要腸道傳染病之一，常常造成養(yǎng)豬企業(yè)的重大損失，對養(yǎng)豬生產危害很大。近年來，延邊地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展勢頭良好，豬大腸桿菌病雖然得到一定控制，但在一些環(huán)境、飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生條件較差的豬場仍時有發(fā)生，發(fā)病率可達30%～50%，嚴重制約該地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。本文對2017年1月至2018年5月延邊地區(qū)的延吉市、龍井市、圖們市的養(yǎng)豬場病死豬及疑似大腸桿菌感染的腹瀉病豬病料進行了病原的分離及鑒定，為該病的診斷及防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2017年1月～2018年5月，共采集了48份病料樣本，其中延吉市15份；龍井市22份；圖們市11份。

1.1.2 實驗動物

健康昆明種小白鼠由延邊大學實驗動物中心提供。

1.1.3 儀器設備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州菲普實驗儀器廠）、超凈工作臺（大連金石實驗室設備有限公司）、全自動高壓滅菌鍋（日本ALP）、生物顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離、純化

將采集的樣本送往實驗室接種于普通肉湯中，37℃培養(yǎng)12～24h。從普通肉湯中取100μL菌液分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基，涂板培養(yǎng)，37℃，24h。挑取單個可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。將純化的細菌保存，革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.2 分離菌的生化鑒定

在超凈工作臺上，分別挑取各純培養(yǎng)物的單個菌落，進行乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇生化、三糖鐵瓊脂試驗、硝酸鹽還原實驗、MR試驗、VP試驗等14項生化鑒定試驗。

1.2.3 致病性試驗

將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯，37℃，18h，將菌液稀釋成1010CFU/mL，試驗小白鼠分為試驗組和對照組，每個組5只小白鼠，試驗組小白鼠腹腔接種稀釋后的菌液，0.3mL/只；對照組小白鼠同時腹腔接種滅菌生理鹽水，0.3mL/只。各組小白鼠單籠隔離飼養(yǎng)，分別于24h、48h觀察小白鼠的狀態(tài)、是否發(fā)病，并做好記錄。

1.2.4 大腸桿菌血清型鑒定

參考方爽的方法進行分離株大腸桿菌O抗原血清型分型。

2 結果

2.1 分離培養(yǎng)結果

純培養(yǎng)后的待檢菌株在麥康凱培養(yǎng)基上出現圓形、表面光滑、濕潤、稍凸起的菌落。菌落呈玫瑰紅色。而在伊紅美蘭培養(yǎng)基上生長的菌落，呈現黑色，略帶金屬閃光，符合大腸桿菌菌落特征。革蘭氏染色后，顯微鏡下可見紫紅色、著色均勻、單個或成對的無莢膜、無芽孢、兩端鈍圓的短桿菌。分離得到40株疑似菌株符合豬大腸桿菌形態(tài)特征。

2.2 生化鑒定結果

對分離得到的40株大腸桿菌菌株進行生化試驗，結果表明，分離菌株均能使葡萄糖、乳糖和蔗糖發(fā)酵；甘露醇、麥芽糖試驗結果為產酸產氣；三糖鐵試驗底層產酸變黃；明膠液化試驗陰性、氧化酶試驗陰性、尿素酶試驗陰性；過氧化氫酶試驗陽性；MR試驗陽性；VP試驗陰性。以上生化試驗結果符合大腸桿菌的特征，表明分離到的菌株為大腸桿菌。

2.3 致病性試驗結果

36株大腸桿菌培養(yǎng)物接種后，試驗組小白鼠48h內全部死亡；另外4株大腸桿菌培養(yǎng)物接種后，48h內有1～2只小白鼠死亡，未死亡小白鼠精神狀態(tài)不佳，飲食飲水減少，出現腹瀉癥狀。而對照組的小白鼠未發(fā)生死亡，全部存活。對死亡的小白鼠進行解剖，觀察病理變化，可見死亡小白鼠的肝臟腫大、質地脆硬、心包膜增厚。取死亡小白鼠的肝臟，涂片染色，顯微鏡檢查，鏡下可見到典型的大腸桿菌。依此判斷本次分離到的40株大腸桿菌均有致病性，其中36株為高致病性菌株，4株為低致病性菌株。

2.4 血清型鑒定

對分離得到的40株大腸桿菌菌株分別進行O抗原血清型鑒定，其中2株定型未成功，1株定型試驗發(fā)生自凝，其余37株分型成功，共鑒定出29個不同的血清型。其中O6（4/37），O 78（5/37）、O 90（7/37）、O 107（7/37）為優(yōu)勢血清型，占全部分離菌株的62.1%。

3 討論

大腸桿菌是各種動物腸道內的常在菌，大腸桿菌血清型眾多，其抗原類型主要有K、O、H組成。據文獻報道，大腸桿菌在不同地區(qū)的血清型分布有很大的差異。本試驗結果顯示，延邊地區(qū)部分豬場此次分離到的大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O6、O78、O90、O107，本次分離菌株鑒定的血清型與國內相關文獻報道的不同地區(qū)分離的豬源性大腸桿菌的血清型有一定的差異性。

大腸桿菌的抗原成分復雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗機體吞噬和抗補體的能力。根據O抗原對大腸桿菌進行血清型分型，至今已發(fā)現170多種血清型。由于大腸桿菌血清型眾多，不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場流行的菌株可能存在很大的差異，給大腸桿菌病的防制帶來了很大的困難。并且隨著時間和地域的變化，大腸桿菌可能會發(fā)生變異，出現新的血清型。本次調查中出現的未定型菌株，可能是大腸桿菌發(fā)生新的變化而出現的新血清型，對這些未定血清型菌株的毒力特征、致病性等應引起重視，并開展相應的研究工作。