耿 威 仉慧穎 李 林 陳 巖 邱一凡

(大慶油田總醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 大慶 163001)

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多因素參與的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活等〔1〕?？赏ㄟ^與靶基因結(jié)合調(diào)控細胞的增殖、凋亡、分化、個體發(fā)育等過程，其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)〔2〕。其中miRNA-21在食管癌、乳腺癌、肺癌等多種實體腫瘤中呈現(xiàn)過表達，參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用〔3,4〕。本研究通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默胃癌細胞中miRNA-21的表達，研究其對細胞增殖及侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。主要試劑和儀器：胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；siRNA和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)、MMP-9、Notch1、Hes1抗體均購自美國Santa Cruz公司；細胞裂解液購自大連寶生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)均購自碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室購自美國Millipore公司；酶標儀購自Bio-Rad公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS；二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱購自德國Heraus公司。

1.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌SGC-7901細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，用0.25%的胰蛋白酶消化后根據(jù)實驗需要傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。轉(zhuǎn)染前2 d以2×104個/孔的濃度將對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長密度達到90%以上時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為正常對照組、轉(zhuǎn)染siRNA Control的陰性對照組和轉(zhuǎn)染siRNA miRNA-21基因的沉默組。整個轉(zhuǎn)染過程嚴格按照Invitrogen 公司的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000方法進行操作。

1.3轉(zhuǎn)染效果檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Oligo6.0軟件設(shè)計目的基因miRNA-21及內(nèi)參基因U6的RT-PCR引物。送由上海生工合成。引物序列上游引物：5'-TGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGG-GTCCGAGGT-3'。按照試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進行熒光定量RT-PCR檢測。

1.4細胞增殖檢測 以1×106個/孔濃度將轉(zhuǎn)染后的各組細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于37℃、5% CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集細胞。每孔細胞中加入CCK8試劑10 μl，37℃反應(yīng)2 h，酶標儀測定A570 nm的吸光度(A570)。細胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細胞A/對照組細胞A)×100%。

1.5細胞侵襲能力檢測 Transwell侵襲小室鋪Matrigel膠，取轉(zhuǎn)染后的各組細胞，0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，用含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基重懸細胞，以每毫升含有5×104個細胞接種于Transwell小室的上室中，Transwell小室的下室中加入500 μl含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集細胞。用棉簽輕輕擦掉上層的Transwell膠，95%的酒精固定15 min，染色，倒置顯微鏡下觀察，隨機取10個不同的視野(×200)進行穿透細胞計數(shù)，試驗重復(fù)3次，計算侵襲細胞的平均數(shù)。

1.6MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達檢測 取轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，加入細胞裂解液提取細胞中的總蛋白。取少量蛋白樣品BCA法檢測蛋白的濃度。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠。取蛋白樣品與上樣緩沖液按照5∶1的比例充分混勻后，100℃變性5 min。取100 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，置于4℃的封閉液中封閉過夜，加入一抗，4℃孵育過夜，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫置于搖床上孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min，洗膜后進行顯影和定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，分析MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染siRNA后SGC-7901細胞中miRNA-21 mRNA表達 轉(zhuǎn)染siRNA后正常對照組(1.000)和陰性轉(zhuǎn)染組(0.991±0.010)miRNA-21 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，沉默組(0.432±0.032)顯著低于正常對照組(P<0.01)。

2.2沉默miRNA-21的表達降低SGC-7901細胞增殖 轉(zhuǎn)染siRNA后沉默組細胞存活率(57.43%±6.98%)顯著低于正常對照組(100.00%)和轉(zhuǎn)染陰性組(97.18%±3.12%，P<0.01)。

2.3沉默miRNA-21的表達降低SGC-7901細胞侵襲能力 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，沉默組細胞侵襲數(shù)〔(91.65±13.21)個〕顯著低于正常對照組和轉(zhuǎn)染陰性組〔(159.65±15.87)個、(158.88±15.12)個，P<0.01〕。

2.4沉默miRNA-21的表達對MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達的影響 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，與正常對照組(0.255±0.036，0.159±0.029，0.511±0.018，0.268±0.029)及轉(zhuǎn)染陰性組(0.551±0.038，0.156±0.030，0.508±0.047，0.270±0.026)比較，沉默組MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達(0.143±0.027，0.058±0.014，0.174±0.028，0.165±0.017)均顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測沉默miRNA-21表達對MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表達的影響

3 討 論

胃癌的發(fā)生是一個多因素多階段的過程，涉及癌基因的活化、抑癌基因的失活、基因啟動子的異常轉(zhuǎn)錄活化、細胞周期調(diào)控失常、表觀遺傳學(xué)等多個方面。有研究顯示miRNA對多種癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程有重要的調(diào)節(jié)功能〔5〕。miRNA-21對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等有調(diào)節(jié)功能，參與多種腫瘤的血管生成、增殖、遷移、抗藥形成等〔6〕。研究顯示，抑制肺癌、食管癌等腫瘤細胞中miRNA-21的表達，可降低癌細胞的增殖及促進細胞凋亡〔7〕。

RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的能使基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，具有高度的特異性、有效性，是研究基因功能的有效方法〔8〕。本研究通過RNAi技術(shù)沉默miRNA-21的表達，結(jié)果顯示細胞的增殖及侵襲能力均顯著降低。腫瘤的侵襲是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，受到多種因素的影響，而MMPs表達改變，尤其是MMP-2和MMP-9表達升高，可通過使基底膜中的Ⅳ型膠原蛋白酶降解，進而增強癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力〔9〕。研究顯示，肺腺癌、宮頸癌等腫瘤中MMP-2和MMP-9的表達升高可使腫瘤對細胞外基質(zhì)(ECM)降解的能力增加，最終導(dǎo)致細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲〔10〕。

Notch1信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在多種器官和組織的早期發(fā)育過程中，其家族成員對調(diào)控細胞的發(fā)育、凋亡、分化等過程有重要作用。由受體和配體及DNA結(jié)合蛋白組成。哺乳動物有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 4個同源的Notch受體，Notch1是主要的受體〔11〕。大量研究顯示，Notch1在各種腫瘤中有致癌作用，胃癌、胰腺癌等腫瘤中下調(diào)Notch1信號通路可降低癌細胞生長及侵襲能力〔12〕。Hes1是Notch1信號通路的一個重要靶基因，是Notch1信號通路激活的標志。本研究結(jié)果顯示，胃癌細胞中沉默miRNA-21的表達可通過抑制Notch1信號通路降低細胞的增殖及侵襲能力，為胃癌的分子診斷及靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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