張爾婷 江 娜 劉 清 彭麗倩 張倩雯 梁碧華 李潤祥 鄧蕙研 李華平 朱慧蘭

人體皮膚受紫外線(Ultraviolet，UV)照射后產(chǎn)生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，并通過信號傳導(dǎo)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成皮膚光損失，老化甚至皮膚癌。氧化應(yīng)激不僅是造成皮膚急性炎癥反應(yīng)如皮膚紅斑，水腫等反應(yīng)的重要因素，同時也是觸發(fā)多種細(xì)胞凋亡的促發(fā)因素[1]。

在防御氧化應(yīng)激的機制中，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)信號通路起著緩解ROS等氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要作用，同時也是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化通路之一。Nrf2在皮膚內(nèi)能廣泛的表達(dá)，尤其是在上皮細(xì)胞，包括表皮角質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)[2]。

目前在與UV誘導(dǎo)疾病的研究中尚無合適的細(xì)胞模型，每次急性光損傷實驗均需重復(fù)UV照射，實驗操作不穩(wěn)定且操作繁瑣，導(dǎo)致實驗結(jié)果難以相互參考。因此建立與檢測Nrf2相關(guān)活性的靈敏可靠方法，是該領(lǐng)域研究的前提。其中分泌型熒光素酶(Gaussia Luciferase，GL)較螢火蟲熒光素酶具有高分泌表達(dá)，檢測靈敏度高，且無需裂解細(xì)胞等優(yōu)點。本研究的目的構(gòu)建一個易檢測、高靈敏的Nrf2信號通路報告系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞，分泌型熒光素酶載體，大腸桿菌質(zhì)粒( 購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞研究所)。

1.2 試劑 Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit(購自Genecopoeai 公司)；lipofec3000脂質(zhì)體(購自Invitrogen公司)。

1.3 設(shè)備 Infinite F200Pro多功能酶標(biāo)儀(購自Invitrogen公司)。UVA照射儀(上海Sigma公司)，UVA照射儀(上海Sigma公司)，紫外線輻射強度測試儀(上海Sigma公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，取出各鋪24板細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入500 uL不含抗生素的完全培養(yǎng)基。

2.2 核苷酸鏈序列設(shè)計 以mini-ML(gtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctcactctcttcc)和mini-CV(gtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggaga)作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列，在其上游的EcoRI和XhoI位點之間分別串聯(lián)1個、2個、4個和8個抗氧化反應(yīng)元件(Anti-oxidant response element, ARE)，各個不同個串聯(lián)元件引物序列如表1所示。同時以CMV啟動子驅(qū)動的堿性磷酸酶(Alkinane Phosphtase, AP)為內(nèi)參報告。

表1 核苷酸序列設(shè)計

2.3 載體的構(gòu)建和分組 引物進行褪火后，與XhoI+EcoRI酶切的載體連接，隨后轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進行測序。根據(jù)所使用的經(jīng)測序驗證后的質(zhì)粒分為2組：以mini-ML為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件，在EcoRI---XhoI之中分別串聯(lián)了1、2、4、8個ARE元件。以mini-CV為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件，在EcoRI---XhoI之中分別串聯(lián)了1、2、4、8個ARE元件。

2.4 轉(zhuǎn)染 HaCaT細(xì)胞一個24孔板鋪板24 h后， 每孔板加入600 ng質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine3000脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine3000說明書[4]，簡述如下：lipo3000每孔加入1 uL，p3000加入1.2 uL。同時HaCaT細(xì)胞的control 均加入等量的lipo3000和p3000而無質(zhì)粒。加入SF(10 uM)和tBHQ(20 uM)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)基上清測定。

2.5 mini-ML序列和mini-CV序列基礎(chǔ)輕錄活性的對比 沒有插入ARE元件的ML空載體(mini-ML)和沒有插入ARE元件的CV空載體(mini-CV)的分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后，以DMSO (Vehicle)，SF(10 μM)和tBHQ(20 μM)處理24 h后，取培養(yǎng)基上清測定。

2.6 分段取樣 ML-8XARE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HaCaT細(xì)胞后，予SF(10 uM)和tBHQ(20 uM)處理，分別于0 h，6 h和24 h，3個時相點取50 μL培養(yǎng)基上清凍存于-80℃，用于測定Gluc和AP活性。

2.7 UV照射后測定Gluc活性 ML-8XARE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HaCaT細(xì)胞后，分別給予20 J/m2的UVA和200 J/m2的進行光照，在光照后的4 h，6 h和24 h的3個時間點取50 μL培養(yǎng)基上清測定Gluc和AP活性，做好標(biāo)記后立即凍存于-80℃。

2.8 測定Gluc和AP活性 取得培養(yǎng)基上清解凍后，采用TECAN公司Infinite F200Pro多功能酶標(biāo)儀，按照其化學(xué)發(fā)光測量辦法，測定Gluc和AP活性，每孔做三次平行轉(zhuǎn)染，進行數(shù)據(jù)收集。通過對ARE轉(zhuǎn)錄原件的串聯(lián)數(shù)目、ARE序列，ARE串聯(lián)間隔序列進行篩選和優(yōu)化，獲得最高靈敏度的ARE序列和串聯(lián)數(shù)目。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計篩選得到最合適的ARE元件串聯(lián)數(shù)目。用SPSS18.0和graphpad prism6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖，采用單因素方差分析(ANOVA)進行假設(shè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同ARE元件的重組質(zhì)粒報告基因載體鑒定的測序結(jié)果 對含重組質(zhì)粒的菌落進行篩選并增菌，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA后，用DNA測序儀試劑盒進行測序。在質(zhì)粒的EcoRI---XhoI之中分別串聯(lián)了1個，2個，4個，8個ARE元件，測序的長度順序結(jié)果(藍(lán)色標(biāo)示區(qū)域)與預(yù)期結(jié)果相一致，見圖1～4。

圖1 1個ARE元件的測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(從左至右均為3’到5’的序列)圖2 2個ARE元件的測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(從左至右均為3’到5’的序列)圖3 4個ARE元件的測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(從左至右均為3’到5’的序列)圖4 1個ARE的元件測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致(從左至右均為3’到5’的序列)

3.2 不同ARE元件數(shù)目

3.2.1 以mini-ML序列作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列，在其后分別插入1，2，4和8個ARE轉(zhuǎn)錄元件，分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞。將沒有插入ARE元件的mini-ML空載體的值設(shè)為1。如圖5所示，當(dāng)插入ARE元件逐漸增多時，Gluc活性發(fā)生了變化，ARE元件逐漸增多時，Gluc的活性越大(P<0.05)，其中ML-8XARE時Gluc的活性最大。

3.2.2 當(dāng)以CV序列作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列，在其后分別插入1，2，4和8個ARE轉(zhuǎn)錄元件，分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后，圖6表明了Gluc 活性變化差異倍數(shù)，以沒有插入ARE元件的ML空載體的值設(shè)為1?？梢姰?dāng)插入ARE元件逐漸增多時，Gluc活性越大(P<0.05)。說明當(dāng)ML-8XARE的Gluc活性最大。

3.3 mini-ML和mini-CV基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的比較 比較不含轉(zhuǎn)錄元件時，檢測mini-ML和mini-CV對抗氧化劑響應(yīng)的情況。由圖7可見ML-Vehicle對三種抗氧化劑的反應(yīng)均小于CV-Vehicle(P<0.05)。說明mini-ML序列本身對抗氧化劑響應(yīng)要遠(yuǎn)小于mini-CV序列，因此在后續(xù)實驗中選用mini-ML作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列。

3.4 抗氧化劑作用不同時間，Gluc活性情況 比較不同時間點的ML-8ARE對抗氧化劑SF和tBHQ的活性反映情況 。圖8表明了Gluc的相對熒光倍數(shù)，即活性變化差異倍數(shù)。結(jié)果顯示當(dāng)選用ML-8ARE時，對SF和tBHQ在處理是作用最強的時間是6 h(P<0.05)。

3.5 UV照射對Gluc活性的影響 轉(zhuǎn)染ML-8ARE質(zhì)粒的HaCaT細(xì)胞，經(jīng)UVA和UVB照射后，各個時間點Gluc活性不同。圖9表明了Gluc活性變化差異倍數(shù)。結(jié)果顯示當(dāng)以ML-8ARE時，UVA和UVB作用24 h時，Gluc活性最強。UVA和UVB之間差異不明顯。

圖5 以mini-ML為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列，不同ARE元件個數(shù)對Gluc活性的影響圖6 以mini-CV為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列，不同ARE元件個數(shù)對Gluc活性的影響

圖7 不含ARE原件時，mini-ML 和mini- CV對抗氧化劑的響應(yīng)圖8 抗氧化劑作用不同時間，Gluc活性情況圖9 UV照射Gluc活性的影響

4 討論

在判斷UV輻射是否導(dǎo)致細(xì)胞損傷以造成UV致急性光損傷模型的實驗中，目前主要通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)或繁瑣的Nrf2核轉(zhuǎn)位等判定手段。在UV導(dǎo)致急性光損傷中沒有合適且易檢測的分子標(biāo)記物。本實驗希望通過建立Nrf2的報告系統(tǒng)，實現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到光損失時，胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，激活Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與ARE結(jié)合，啟動Nrf2的報告系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌到胞外，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。希望通過檢測Nrf2的報告系統(tǒng)的活性，從而判斷Nrf2的激活情況及細(xì)胞受到急性光損傷的情況。

目前，關(guān)于Nrf2的報告系統(tǒng)的主要有β-半乳糖、螢火蟲熒光素酶、綠色熒光蛋白等。β-半乳糖的報告系統(tǒng)翻譯過程較復(fù)雜，且不能應(yīng)用于順勢表達(dá)和單細(xì)胞以上水平的研究。螢火蟲熒光素酶、綠色熒光蛋白和Gluc一樣，同屬熒光蛋白家族，具有無需其它外源因子的參與自有熒光機制;熒光不干擾細(xì)胞和組織的正常生長和功能[4]，觀察過程選用顯微鏡等設(shè)備即可完成等優(yōu)點。Gluc檢測靈敏度高螢火蟲熒光素酶的1000倍以上，在多種哺乳動物細(xì)胞中均能高效的分泌表達(dá)，具有無需裂解細(xì)胞，檢測方便快捷，可實現(xiàn)長期活性的監(jiān)測的優(yōu)點。因此本實驗選用Gluc作為報告基因。

本實驗中，為了建立以Gluc為報告基因的Nrf2報告系統(tǒng)，我們選取了8個ARE元件分別插入質(zhì)粒的EcoRI---XhoI中，并以CMV啟動子驅(qū)動的AP為內(nèi)參報告。采用抗氧化劑SF和tBHQ篩選出不同時間(0 h，6 h及24 h)時的熒光強度，結(jié)果表明6 h時熒光強度最高。抗氧化劑處理正常細(xì)胞，可迅速激活Nrf2通路，并在6 h時達(dá)到最高，但隨時間的延長，抗氧化劑的活性逐漸降低，此后細(xì)胞本身的反饋抑制機制導(dǎo)致Nrf2通路回復(fù)到正常水平而下降。當(dāng)采用不同波長的UV，即UVA和UVB時，熒光強度在24 h時達(dá)到最高，主要原因在于當(dāng)受到紫外照射后，細(xì)胞受到應(yīng)急損傷，有可能發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而啟動細(xì)胞本身的抗氧化機制。而啟動這一抗氧化機制是個相對比較緩慢的過程，因此在24 h時熒光強度最強。綜上結(jié)果，我們在實際應(yīng)用該報告系統(tǒng)時，應(yīng)同時測量6 h和24 h的ML-8ARE的熒光強度以避免細(xì)胞2種不同的反應(yīng)機制對結(jié)果造成的影響。

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[3] Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription[J]. Anal Biochem,1990,188:245-254.

[4] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Greenfluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science,1994,263:802-805.