馬群飛

2016年11月18日，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會網(wǎng)站公布了一系列食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，其中GB 4789.15－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（以下簡稱2016版標(biāo)準(zhǔn)）實施日期為2017年4月19日[1]。這個標(biāo)準(zhǔn)方法在目前各個食品檢驗機(jī)構(gòu)和企業(yè)微生物實驗室使用頻率比較高。在2016版標(biāo)準(zhǔn)的前言中，雖然描述了對GB 4789.15－2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》[2]修改的主要章節(jié)，但是沒有明確是如何修訂的。因為在具體操作細(xì)節(jié)方面要求更為細(xì)致，檢驗機(jī)構(gòu)困惑較多，實際工作中也可能出現(xiàn)偏差，影響標(biāo)準(zhǔn)的實施效果。為了幫助微生物檢驗人員更好地理解標(biāo)準(zhǔn)的變化，我們對2016版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解讀。

1 范圍

2016版標(biāo)準(zhǔn)的前言中，沒有描述對于“范圍”這個章節(jié)進(jìn)行了修改。除了將原來使用的術(shù)語“霉菌和酵母菌”按照標(biāo)準(zhǔn)名稱統(tǒng)一規(guī)范為“霉菌和酵母”外，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“第二法適用于番茄醬罐頭、番茄汁中霉菌的計數(shù)?！贝颂帯肮揞^”這個名詞運(yùn)用的不準(zhǔn)確。實際上，只要是番茄醬、番茄汁，無論是否罐頭，或其他包裝形式，都適用于第二法檢驗。

2 設(shè)備和材料

2016版標(biāo)準(zhǔn)將均質(zhì)器類型明確為拍擊式均質(zhì)器或均質(zhì)袋（2.2）。以往版本標(biāo)準(zhǔn)是規(guī)定采用振蕩的方式來進(jìn)行樣品表面的沖洗，均質(zhì)程度不足。另外有些檢驗機(jī)構(gòu)，使用旋轉(zhuǎn)刀片均質(zhì)器，可能會把霉菌的菌絲切斷，導(dǎo)致檢驗結(jié)果偏高。所以，2016版標(biāo)準(zhǔn)對均質(zhì)方式進(jìn)行了明確的規(guī)定。無菌試管規(guī)格由10 mm×75 mm修改為18 mm×180 mm（2.6）。使用較為粗大的試管，有利于樣品稀釋液的混勻，否則在小試管里面很難充分混勻。增加了微量移液器及吸頭1.0 mL（2.11），這是為了兼容檢驗機(jī)構(gòu)實際工作中常用的方式。建議購買可整支高壓滅菌的移液器，避免因反復(fù)吹吸導(dǎo)致微生物污染。刪除了500 mL無菌廣口瓶、牛皮紙袋這一類包裝材料，原因是現(xiàn)在檢驗機(jī)構(gòu)的使用率很低。刪除了標(biāo)準(zhǔn)中沒有用到的冰箱和恒溫振蕩器，增加了漩渦混合器和恒溫水浴。主要是反復(fù)吹吸方式混勻樣品稀釋液，容易形成有害氣溶膠，并增加污染機(jī)會，用漩渦混合器可以保證樣品稀釋液的均勻，減少污染。恒溫水浴主要為了準(zhǔn)確控制傾注瓊脂的溫度。對于郝氏計測玻片（2.13），還是沿用了以往的翻譯習(xí)慣，但缺少了相應(yīng)的英文描述，容易引起歧義，最好是描述為“郝氏（Howard）計測玻片”。

3 培養(yǎng)基和試劑

2016版標(biāo)準(zhǔn)中增加了生理鹽水和磷酸鹽緩沖液，保留無菌蒸餾水作為稀釋液。增加兩種稀釋液，也是為了配合實驗室工作，因為經(jīng)常是同一份食品樣品，需要同時檢驗菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母等等多個微生物項目。若每一份都重新稱重更換稀釋液，實驗室工作量太大，也難以保證落實。而生理鹽水和磷酸鹽緩沖液對于生物細(xì)胞的保護(hù)作用明顯優(yōu)于無菌蒸餾水。實際上，僅僅是檢驗高鹽食品（如水產(chǎn)調(diào)味品、腌菜等）時，無菌蒸餾水可能更適用。另外，將“馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基”書寫方式改為“馬鈴薯葡萄糖瓊脂”，“孟加拉紅培養(yǎng)基”改為“孟加拉紅瓊脂”。

4 檢驗程序

流程圖稍有修改。蒸餾水改為稀釋液，明確了樣品勻液的添加方式，以及培養(yǎng)基添加量明確在20 mL以上。

5 操作步驟

5.1 樣品的稀釋

本條除了稀釋步驟，還規(guī)定了樣品接種和空白對照。所以，本條標(biāo)題應(yīng)該是“樣品稀釋和接種”。另外，5.1.1對于固體和半固體樣品的稀釋，允許“充分振搖”。這樣描述，會導(dǎo)致一些檢驗機(jī)構(gòu)對于塊狀食品樣品振搖后就進(jìn)行下一步操作，微生物還沒有從食品團(tuán)塊中釋放出來，影響檢驗效果。2016版標(biāo)準(zhǔn)中，除了增加了生理鹽水及磷酸鹽緩沖液外，還將每平皿中馬鈴薯葡萄糖瓊脂和孟加拉紅瓊脂的添加量由15 mL～20 mL改為20 mL～25 mL（5.1.6），這是為了符合GB 4789.28－2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》對于培養(yǎng)時間超過48 h的培養(yǎng)基應(yīng)傾注4 mm左右的厚度和20 mL以上量的強(qiáng)制性規(guī)定[3]。增加了“置水平臺面待培養(yǎng)基完全凝固”的規(guī)定。雖然標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定梯度稀釋時可以用無菌吸管反復(fù)吹吸，但是為了避免形成有害氣溶膠，減少污染機(jī)會，建議檢驗機(jī)構(gòu)盡量使用漩渦混合器來混勻稀釋液。

5.2 培養(yǎng)

2016版標(biāo)準(zhǔn)將培養(yǎng)方式修改為平板應(yīng)正置培養(yǎng)，是為了避免在培養(yǎng)過程中，因為需要多次觀察而反復(fù)上下反轉(zhuǎn)平板導(dǎo)致霉菌孢子擴(kuò)散形成次生小菌落，最終影響計數(shù)結(jié)果。把“培養(yǎng)5 d，觀察并記錄”修改為“觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果?！北苊馀囵B(yǎng)到5 d后才進(jìn)行觀察，而出現(xiàn)霉菌菌落已經(jīng)蔓延無法計數(shù)甚至導(dǎo)致培養(yǎng)箱污染的情況。因為光照會促進(jìn)孟加拉紅分解，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的霉菌和酵母檢驗方法也專門規(guī)定在暗處培養(yǎng)[4]，所以，雖然2016版標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定，檢驗機(jī)構(gòu)也應(yīng)避免使用透明門的培養(yǎng)箱或?qū)⑵桨宸旁谟泄庹盏臈l件下培養(yǎng)。

5.3 菌落計數(shù)

將上一個版本“霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計”這個錯誤規(guī)定修改為“霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為菌落蔓延”。本條的主要技術(shù)問題是如何“根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母”，畢竟霉菌和酵母不是分類學(xué)的名詞，單從菌落外觀進(jìn)行區(qū)別判定容易引起爭議。而在ISO標(biāo)準(zhǔn)中，就有較為明確的描述[5]。在被2016版標(biāo)準(zhǔn)替代的SN/T 2552.3－2010《乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法 第3部分：酵母、霉菌菌落計數(shù)》中，規(guī)定“排除可能生長的異常細(xì)菌菌落。必要時，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征區(qū)分酵母和霉菌菌落”[6]，這樣的描述似乎更合理。畢竟某些細(xì)菌可能耐受抗生素而形成菌落造成計數(shù)干擾，通過形態(tài)學(xué)特征（如低倍鏡檢等）可以區(qū)分霉菌和酵母及細(xì)菌菌落。FDA和ISO的標(biāo)準(zhǔn)方法也有類似要求[4-5]。建議檢驗機(jī)構(gòu)通過作業(yè)指導(dǎo)書形式來完善這部分步驟。

6 結(jié)果與報告

6.1 結(jié)果

增加了兩種結(jié)果的計算方法：若有兩個稀釋度平板上菌落數(shù)均在10 CFU～150 CFU，則按GB 4789.2的公式進(jìn)行計算（6.1.2）[7]。因為這種情況還是比較經(jīng)常出現(xiàn)的。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在10 CFU～150 CFU，其中一部分小于10 CFU或大于150 CFU時，則以最接近10 CFU或150 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算（6.1.6）。這些都是原來標(biāo)準(zhǔn)沒有規(guī)定的。

6.2 報告

以前的霉菌和酵母計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)中，對計數(shù)結(jié)果的最終報告方式缺少詳細(xì)的規(guī)定。2016版標(biāo)準(zhǔn)參照了GB 4789.2的計數(shù)方法[7]，增加了“若空白對照平板上有菌落出現(xiàn)，則此次檢測結(jié)果無效”的內(nèi)容（6.2.3）。明確了“菌落數(shù)在10以內(nèi)時，采用一位有效數(shù)字報告”（6.2.1）。上個版本，是規(guī)定“菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按照四舍五入原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告?！崩缬械臋z驗機(jī)構(gòu)就按照這樣的規(guī)定，將10以內(nèi)的菌落數(shù)報告成8.5。

7 操作步驟（第二法 霉菌直接鏡檢計數(shù)法）

這個章節(jié)，主要是增加了7.6報告條款，明確了最終的報告方式為“視野%”。存在的問題，一是“7.3 涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標(biāo)準(zhǔn)液，用玻璃棒均勻的攤布于計測室，以備觀察”。這里的“標(biāo)準(zhǔn)液”，其實應(yīng)該是“樣品稀釋液”。二是“7.5 結(jié)果與計算：……或三根菌絲總長度超過標(biāo)準(zhǔn)視野的1/6（即測微器的一格）時即記錄為陽性（＋）”，實際上，標(biāo)準(zhǔn)視野的1/6并不是測微器的一格。這兩處都屬于描述錯誤。

8 附錄A 培養(yǎng)基及試劑

2016版標(biāo)準(zhǔn)的這個章節(jié)中，增加了生理鹽水、磷酸鹽緩沖液配方。其余技術(shù)性修改，主要是將馬鈴薯葡萄糖瓊脂和孟加拉紅瓊脂的滅菌時間由2010版本的20 min修改為15 min（A.2.2、A.3.2），并增加了對孟加拉紅瓊脂避光保存?zhèn)溆玫囊?，因為太長時間的高壓滅菌可能會破壞糖類，光照會促進(jìn)孟加拉紅分解。另外，刪除了2010版本“傾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培養(yǎng)基中”的規(guī)定[2]，因為氯霉素能夠耐高壓滅菌，可以直接添加在培養(yǎng)基中再殺菌，這樣就簡化了相對繁瑣的配制步驟。

9 存在的問題

2016版標(biāo)準(zhǔn)依然沒有解決兩個技術(shù)問題：一是沒有改變使用28℃培養(yǎng)，與美國FDA或ISO標(biāo)準(zhǔn)用較低溫度（25℃）培養(yǎng)的技術(shù)性差異問題[4，5，8]；二是沒有明確如何區(qū)分霉菌和酵母的菌落形態(tài)分別計數(shù)報告的問題。期待隨著檢驗技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來版本的標(biāo)準(zhǔn)能夠予以解決。

[1] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 4789.15－2016. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)[S]. 2016. 引用時間：20170419. 網(wǎng)址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/32AA7ED2-89E4-4660-8194-C5FC7EE00856.html.

[2] 中華人民共和國國家衛(wèi)生部. GB 4789.15－2010. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)[S]. 2010.引用時間：20170808. 網(wǎng)址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/F39FC94AC37D-44D6-A3A7-2997FEAA7B5F.html.

[3] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 4789.28－2013. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S]. 2013. 引用時間：20170808.網(wǎng)址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/3B34B8D6-7164-4419-B308-6AF683E8B606.html.

[4] Food and Drug Administration.Bacteriological Analytical Manual Chapter 18: Yeasts，Molds and Mycotoxins[S].2001. 引用時間：20170808. 網(wǎng)址：https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071435.html.

[5] International Organization for Standardization. ISO 21527-1:2008.Microbiology of food and animal feeding stuffs － Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds － Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0，95[S].2008. 引 用 時 間：20170808. 網(wǎng) 址：https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:21527:-1:ed-1:v1:en.

[6] 中華人民共和國國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T 2552.3－2010.乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法 第3部分：酵母、霉菌菌落計數(shù)[S]. 2010. 引用時間：20170808.網(wǎng)址：http://www.eshian.com/standards/18265.html.

[7] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理總局. GB 4789.2－2016. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定[S]. 2016. 引用時間：20170808. 網(wǎng)址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/F23DE741-721F-4C68-BDB1-F42440C66858.html.

[8] International Organization for Standardization. ISO 6611:2004.Milk and milk products—Enumeration of colony-forming units of yeasts and/or moulds—Colony-count technique at 25℃ [S]. 2004. 引用時間：20170808. 網(wǎng)址：https://www.iso.org/standard/40473.html.