王 芬 朱紅霞 高玉斌

(武漢市中心醫(yī)院新洲院區(qū)內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430400)

眾所周知，免疫因素在2型糖尿病(T2DM)發(fā)病過(guò)程中起到重要作用，T2DM患者常存在自身免疫系統(tǒng)的紊亂〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者體內(nèi)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞可與胰島素發(fā)生免疫反應(yīng)，從而損害胰島組織，促進(jìn)病情發(fā)展〔2，3〕。外周組織中具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)可以調(diào)控自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能，防止其對(duì)自身組織器官，如胰島組織產(chǎn)生損害。因此，Treg細(xì)胞在T2DM發(fā)病過(guò)程中起到重要作用，其功能受損與T2DM的發(fā)病密切相關(guān)〔4～6〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞可以調(diào)控T細(xì)胞對(duì)胰島細(xì)胞的自身反應(yīng)性〔7～10〕。本研究旨在探討T2DM患者和正常人外周血中Treg細(xì)胞的比例與功能的變化。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選擇2016年2～9月在新洲醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的60例T2DM患者為研究對(duì)象，歸為2型糖尿病組(T2DM組)，男35例，女25例，年齡42～76歲，平均(57.4±12.8)歲。另選擇同期在院體檢的20例健康人作為對(duì)照組，男11例，女9例，年齡40～75歲，平均(55.1±11.9)歲。所有研究對(duì)象研究前均未接受放射性治療，化療或其他的治療。所有研究對(duì)象對(duì)本次研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2儀器與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基(含RPMI、10%FBS、55 mmol/L 2-mercaptoethanol、2 mmol/L L-glutamine、10 μg/ml gentamicin、10 μmol/L HEPES)。流式分析儀器購(gòu)自BD公司。流式熒光抗體購(gòu)自Ebioscience公司。

1.3方法

1.3.1提取外周血單個(gè)核細(xì)胞 取研究對(duì)象25 ml外周靜脈血，采用Ficoll-Paque (Sigma，CA，USA)梯度離心。

1.3.2細(xì)胞分選 采用CD4+CD25+Foxp3+CD127-磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)分選調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，采用CD4+CD25-磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)分選CD4+CD25-T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)純度均在95%以上。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)分析樣品的制備 將細(xì)胞重懸在200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細(xì)胞標(biāo)2 μl流式抗體。置4℃冰箱中避光孵育20 min，用1 ml PBS洗一次。先標(biāo)表面分子，再核固定標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。取300 μl PBS上流式儀器分析。

1.3.4體外抑制實(shí)驗(yàn) 將CFSE標(biāo)記(終濃度2 μmol/L)的CD4+CD25-T細(xì)胞與Treg細(xì)胞共培養(yǎng)5 d，共培養(yǎng)比例為1∶1或者1∶0，分析CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖情況。抑制率計(jì)算公式：抑制率(%)=〔1-(有Treg共培養(yǎng)的增殖率/沒(méi)有Treg共培養(yǎng)的增殖率)〕×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graph Pad Prism5.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血Treg細(xì)胞在淋巴細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞中的比例 將表達(dá)CD4+CD25+Foxp3+CD127-定義為T(mén)reg細(xì)胞。T2DM組〔(0.62±0.09)%〕與對(duì)照組〔(0.65±0.10)%〕中Treg細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T2DM組〔(1.76±0.23)%〕與對(duì)照組〔(1.81±0.27)%〕中Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組外周血Treg細(xì)胞中Foxp3表達(dá)強(qiáng)度比較 Treg細(xì)胞主要特征是表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，F(xiàn)oxp3的表達(dá)與Treg細(xì)胞的抑制性功能密切相關(guān)。與對(duì)照組相比，T2DM患者Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)強(qiáng)度(MFI)明顯降低〔(21.05±2.2)vs(32.43±3.12)，P=0.023〕。

2.3兩組外周血Treg細(xì)胞抑制能力比較 體外抑制實(shí)驗(yàn)顯示，T2DM患者外周血Treg細(xì)胞抑制能力明顯低于對(duì)照組〔(31.17±3.78)% vs (58.62±4.98)%，P=0.019〕。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，患者外周血Treg細(xì)胞比例沒(méi)有顯著變化，這說(shuō)明T2DM患者外周血中所含的Treg細(xì)胞的比例沒(méi)有發(fā)生異常，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞平衡的改變，不是導(dǎo)致T2DM患者免疫抑制能力缺陷的原因。雖然Treg細(xì)胞比例沒(méi)有發(fā)生顯著變化，但是其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的MFI顯著降低；同時(shí)，Treg細(xì)胞的抑制功能也顯著減弱。在研究結(jié)果中，來(lái)源于健康人的外周血Treg細(xì)胞可以有效地抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖。相反，來(lái)源于T2DM患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞無(wú)法有效地抑制自體對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖。

近年的研究表明，Treg細(xì)胞失能與Foxp3的表達(dá)降低或者異常有關(guān)〔11～14〕。本研究結(jié)果與之前的研究相一致，發(fā)現(xiàn)T2DM患者的免疫抑制功能缺失，很大程度上是由于Treg細(xì)胞的失能，很可能是由于這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3不穩(wěn)定，正如本研究觀察到的Foxp3表達(dá)MFI降低，使Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)H1，TH2，TH17等效應(yīng)細(xì)胞。目前關(guān)于Treg細(xì)胞失能與T2DM患者之間直接聯(lián)系還有待深入研究。但是，Treg細(xì)胞的受損解釋了為什么T2DM患者對(duì)自身抗原耐受的紊亂導(dǎo)致了患者更易發(fā)生自身免疫性疾病。關(guān)于T2DM患者Treg細(xì)胞失能的具體機(jī)制，還需要進(jìn)一步探究。

1Kornete M，Mason ES，Piccirillo CA.Immune regulation in T1D and T2D：Prospective role of foxp3+Treg cells in disease pathogenesis and treatment〔J〕.Front Endocrinol (Lausanne)，2013；4(1)：76.

2Di Lorenzo TP，Peakman M，Roep BO.Translational mini-review series on type 1 diabetes：Systematic analysis of T cell epitopes in autoimmune diabetes〔J〕.Clin Exp Immunol，2007；148(1)：1-16.

3Arif S，Tree TI，Astill TP，etal.Autoreactive T cell responses show proinflammatory polarization in diabetes but a regulatory phenotype in health〔J〕.J Clin Invest，2004；113(3)：451-63.

4Shen BL，Qu QS，Miao SZ，etal.Study on the effects of regulatory T cells on renal function of IgAN rat model〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015；19(2)：284-8.

5Fontenot JDL，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells〔J〕.Nat Immunol，2003；4(4)：330-6.

6Kim JML，Rasmussen JP，Rudensky AY.Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice〔J〕.Nat Immunol，2007；8(2)：191-7.

7Hall BM.T Cells：Soldiers and spies-the surveillance and control of effector t cells by regulatory T cells〔J〕.Clin J Am Soc Nephrol，2015；10(11)：2050-64.

8Matejuk A，Beardall M，Xu Y，etal.Exclusion of natural autoantibody-producing B cells from IgG memory B cell compartment during T cell-dependent immune responses〔J〕.J Immunol,2009；182(12)：7634-43.

9Zeng C，Shi X，Zhang B，etal.The imbalance of Th17/Th1/Tregs in patients with type 2 diabetes：relationship with metabolic factors and complications〔J〕.J Mol Med，2012；90(2)：175-86.

10Dhuban BK，Kornete M，Mason SE，etal.Functional dynamics of Foxp3+regulatory T cells in mice and humans〔J〕.Immunol Rev，2014；259(1)：140-58.

11Chauhan SK，Saban DR，Lee HK，etal.Levels of Foxp3 in regulatory T cells reflect their functional status in transplantation〔J〕.J Immunol，2009；182(1)：148-53.

12Moes N，Rieux-Laucat F，Begue B，etal.Reduced expression of Fox P3 and regulatory T-cell function in severe forms of early-onset autoimmune enteropathy〔J〕.Gastroenterology，2010；139(3)：770-8.

13Long SA，Cerosaletti K，Bollyky PL，etal.Defects in IL-2R signaling contribute to diminished maintenance of FOXP3 expression in CD4(+)CD25(+) regulatory T-cells of type 1 diabetic subjects〔J〕.Diabetes，2010；59(2)：407-15.

14Francisco C，Catai A，Moura-Tonello S，etal.Cytokine profile and lymphocyte subsets in type 2 diabetes〔J〕.Brazilian J Med Biol Res，2016；49(4)：e5062.