王鳳杰 李 冬 余 磊 崔艷芳 葉華虎 法云智③ 楊貴波

(中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心，北京 102206)

白介素17受體(Interleukin 17 receptor，IL- 17R)是表達(dá)在IL- 17家族細(xì)胞因子靶細(xì)胞表面的跨膜分子。IL- 17受體家族包括IL- 17RA、B、C、D、E五個成員，其中IL- 17RA是首個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物IL- 17受體，與IL- 17RC形成復(fù)合體，是IL- 17A、IL- 17A- IL- 17F、IL- 17F信號通路中必不可少的成分[1,2]。IL- 17R家族成員包含一個保守的SEFIR結(jié)構(gòu)域，在與IL- 17A結(jié)合后， IL- 17RA/IL- 17RC的SEFIR與下游的ACT1相互作用激活下游信號，最終激活NF- κB信號通路[3- 5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能夠被IL- 17A激活的轉(zhuǎn)錄因子還有AP- 1、C/EBP- δ和C/EBP- β等[6]。此外，IL- 17A還參與MAPK、JNK、ERK及P38等信號通路的活化[6]，并可能參與PI3K信號的激活[3]。激活I(lǐng)L- 17R通路可刺激多種細(xì)胞因子 (IL- 6、G- CSF、GM- CSF)、趨化因子(CCL2、CCL7、CCL20、CXCL1、CXCL5)、抗菌肽(β- defensin- 2、S100A7、S100A8、S100A9)、黏蛋白(MUC5B、MUC5AC)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP3、MMP9、MMP12、MMP13)的形成[7],一方面抑制上皮細(xì)胞周圍細(xì)菌的繁殖，維持腸道上皮屏障功能，增強(qiáng)腸道上皮的緊密連接結(jié)構(gòu)，阻止腸內(nèi)細(xì)菌或內(nèi)毒素移位到其他組織器官；另一方面參與機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[8]，在自身免疫性疾病、宿主防御和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

已知IL- 17R在人和小鼠體內(nèi)廣泛分布，造血組織中表達(dá)水平相對較高。Northern blot分析表明，小鼠的脾臟和腎臟IL- 17RA表達(dá)水平較高，其次為肺臟和肝臟，而在腦、心臟、骨骼肌和睪丸組織中的表達(dá)水平較低；IL- 17RA在鼠腸道上皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及淋巴瘤細(xì)胞中均有高水平的表達(dá)，而在胚胎肝臟上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平較低[9]。利用定量PCR對小鼠組織中IL- 17R轉(zhuǎn)錄水平的分析表明，胸腺中IL- 17RA水平最高，分別為脾臟和肺中的1.5倍和4倍，在淋巴結(jié)、大腸和小腸中IL- 17RA低水平表達(dá)；而IL- 17RC在大腸和小腸中表達(dá)水平最高，為肺中的1.5倍，胸腺和脾臟中IL- 17RC水平也顯著低于腸道，淋巴結(jié)中幾乎不表達(dá)IL- 17RC。在免疫細(xì)胞中IL- 17RA和IL- 17RC的水平也存在差異，IL- 17RA在巨噬細(xì)胞中水平最高，其次為T淋巴細(xì)胞，而在B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中水平相對較低；IL- 17RC在巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中低水平表達(dá)，B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞幾乎不表達(dá)[10]。

恒河猴與人類親緣關(guān)系較近，被廣泛用于建立人類疾病研究的動物模型，在艾滋病、腸道炎癥性疾病、肝炎等多種疾病的研究中具有不可替代的作用。目前已知IL- 17/IL- 17R通路與免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病密切相關(guān)[11- 13]，而恒河猴可在這些疾病的研究中發(fā)揮重要作用，但對恒河猴IL- 17/IL- 17R通路的研究甚少。本研究組曾對恒河猴Th17細(xì)胞、IL- 17A及其在猴艾滋病中的作用進(jìn)行過研究[14,15]，但I(xiàn)L- 17R在恒河猴體內(nèi)的表達(dá)及分布情況至今尚無報(bào)道。本文建立定量PCR方法觀察了恒河猴中IL- 17RA mRNA的分布,并比較了恒河猴、食蟹猴和非洲綠猴PBMC中IL- 17RA和IL- 17RC mRNA的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)，凝膠回收試劑盒(Qiagen)，質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega)，RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System- SP6 and T7(Promega)，One Step PrimeScriptTMRT- PCR Kit(TaKaRa)，淋巴細(xì)胞分層液(GE),組織RNA提取試劑盒(天根生物科技)。

1.1.2組織和細(xì)胞 本研究使用了-80℃保存的脾臟、胰臟等36種組織(詳見結(jié)果)，來自5只正常中國恒河猴(3只為雌性，2只為雄性，年齡1～2周歲)。PBMC分別來自恒河猴、非洲綠猴、食蟹猴(各10只)，通過外周血淋巴細(xì)胞分層液梯度離心法獲取。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取 根據(jù)組織RNA提取試劑盒說明書提取組織及PBMC中的RNA,加100 μl RNase Free H2O洗脫RNA產(chǎn)物，分裝后于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2IL- 17R標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

1.2.2.1目的片段擴(kuò)增 使用恒河猴正常組織中提取的RNA進(jìn)行RT- PCR 擴(kuò)增,IL- 17RA基因擴(kuò)增片段長414 bp，上下游引物序列分別為5′- CTC CCA GCC GGG GCT AAA CTG- 3′,5′- AGG AAA TTC TTG GAC TGG TGG- 3′；IL- 17RC基因擴(kuò)增片段長582 bp，上下游引物序列分別為5′- TAG AAG ATG CCT GTG CCC TGG TT- 3′， 5′- AGG CAG CTG CTG TGT GAG GTT GA- 3′。

1.2.2.2RT- PCR產(chǎn)物回收和克隆 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按照凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段并鑒定濃度及純度。將回收產(chǎn)物與pGEM- T Easy Vector連接。

1.2.2.3質(zhì)粒重組轉(zhuǎn)化及陽性克隆的篩選 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并于Amp抗性的LB瓊脂平板上37℃過夜培養(yǎng)，挑取單一菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,對質(zhì)粒進(jìn)行測序及序列分析，保存測序正確的質(zhì)粒。

1.2.2.4質(zhì)粒線性化和體外轉(zhuǎn)錄 用限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收線性化質(zhì)粒。按照RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System- SP6試劑盒說明書對線性化的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

1.2.2.5RNA標(biāo)準(zhǔn)品的定量和稀釋 測定體外轉(zhuǎn)錄并純化后的RNA樣品濃度及純度，用RNase Free H2O對RNA 進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，分裝后存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3熒光定量PCR檢測 用One Step Prime ScriptTMRT- PCR Kit對樣品進(jìn)行熒光定量分析，選用GAPDH作為內(nèi)參基因，反應(yīng)程序如下：第一步反應(yīng)為42℃ 5 min，95℃ 10 s；第二步反應(yīng)為95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環(huán)數(shù)為40。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析軟件為ABI7500,檢測基因及內(nèi)參基因的引物和探針序列見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，兩組數(shù)據(jù)間用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1恒河猴各組織中IL- 17RA基因的表達(dá)水平 為了解免疫系統(tǒng)中IL- 17R的分布，本研究檢測了中樞淋巴組織(骨髓、胸腺)和外周淋巴組織(淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體等)中IL- 17RA的表達(dá)水平。總體而言，IL- 17RA在免疫相關(guān)組織中表達(dá)量相對較高，其中僅髂淋巴結(jié)、骶淋巴結(jié)、胸腺和扁桃體中表達(dá)量略低于50 000 copies/106GAPDH，其余組織均高于50 000 copies/106GAPDH，腹股溝淋巴結(jié)的表達(dá)量最高，其次為腋窩淋巴結(jié)，扁桃體中表達(dá)量最低，IL- 17RA基因的表達(dá)量僅在腹股溝淋巴結(jié)和扁桃體中存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.044 2)，見圖1A。

與免疫系統(tǒng)相比，消化道中IL- 17RA的表達(dá)水平普遍偏低，口腔黏膜IL- 17RA表達(dá)量最低，僅為2 810 copies/106GAPDH。大腸的表達(dá)水平高于小腸，大腸中盲腸IL- 17RA表達(dá)水平最高，結(jié)腸近端表達(dá)水平最低，小腸中十二指腸近端水平最高，空腸中部表達(dá)水平最低。 IL- 17RA在十二指腸近端、空腸近端、空回腸中部和回腸末端這四個部位的表達(dá)水平均與盲腸存在明顯的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025 7，P=0.018 9，P=0.013 3，P=0.020 6)，見圖1B。

本試驗(yàn)所選取的5只恒河猴中有三只為雌性，兩只為雄性。本研究檢測了雌性動物的子宮頸、子宮體、卵巢、陰道以及雄性動物的睪丸和包皮中IL- 17RA的表達(dá)情況，在雌性恒河猴的子宮頸和雄性恒河猴的睪丸中IL- 17RA表達(dá)水平較高。但生殖器官中IL- 17RA水平均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且不存在明顯的性別差異，見圖1C。

除上述組織外，本研究還對胰臟、肺臟、肝臟、腎臟、心臟等內(nèi)臟器官及大腦、主動脈、氣管、皮膚、肌肉等組織進(jìn)行了檢測，其中胰臟IL- 17RA的水平最高，其次依次為肺臟、肝臟、腎臟、皮膚、主動脈和氣管，大腦、心臟和肌肉中表達(dá)量均低于10 000 copies/106GAPDH，在所有檢測的組織中，肌肉IL- 17RA表達(dá)水平最低，僅為370 copies/106GAPDH，見圖1D。

對免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)相關(guān)組織中IL- 17RA的表達(dá)水平進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)， IL- 17RA在各系統(tǒng)中的表達(dá)水平不一致，在免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)中的表達(dá)兩兩之間差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1E。

2.2恒河猴腸道組織中IL- 17RC基因的表達(dá)水平 IL- 17RC在消化道組織中廣泛表達(dá)，大腸中IL- 17RC的表達(dá)水平略高于小腸，大腸中直腸含量最高，其次是結(jié)腸和盲腸。但與IL- 17RA相比，IL- 17RC在大腸中的含量偏低。小腸中空腸近端表達(dá)水平最高，十二指腸近端和回腸末端含量相當(dāng)，IL- 17RC在十二指腸近端和回腸末端的表達(dá)水平均與直腸存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.023 1，P=0.011 5)，見圖2。

表1基因引物和探針序列

Tab.1Primerandprobesequenceofgenes

GenenameLengthPrimersequence(5'-3')Probesequence(5'-3')IL-17RA162bpTGGATTCACCCTCGAAACCTFAM-CACTGCAGACAGACGCCAGCATCC-TAMRAAGATAACTCTGCACCCTCGAGGTAIL-17RC311bpTAGAAGATGCCTGTGCCCTGGTTFAM-CTGGTGCTGAGGTGCCGCAAGGAGA-TAMRATCATCTTCAGGTTCTTCCCAGTGGAPDH71bpGACCACAGTCCATGCCATCAFAM-ACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCC-TAMRACATCACGCCACAGTTTCCC

圖1 IL- 17RA mRNA在恒河猴不同組織中的分布Fig.1 Distribution of IL- 17RA mRNA in different tissues of rhesus macaquesNote: A.Distribution of IL- 17RA in lymphoid tissues;BM.Bone marrow;Thy.Thymus；Spl.Spleen；Axi LN.Axillary lymph node;Mes LN.Mesentery lymph node;Lum LN.Lumbar lymph node；Sac LN.Sacral lymph node；Ili LN.Iliac lymph node；Ing LN.Inguinal lymph node；Ton.Tonsil;B.Distribution of IL- 17RA in digestive tract;Ora.Oral cavity；Sto.Stomach fundic；Duo- p.Duodenum proximal；Jei- p.Jejunum proximal；Ji- m.Jejunoileum middle；Ile- d.Ileum distal；Cae.Caecum；Col- p.Colon proximal；Col- m.Colon middle；Rec.Rectum;* showed statistically significance between Cae and Duo- p,Cae and Jej- p,Cae and Ji- m,Cae and Ile- d,Cae and Col- p,P<0.05；C.Distribution of IL- 17RA in genital tissues；D.Distribution of IL- 17RA in other tissues；E.Difference in IL- 17RA mRNA levels between the lymphoid ,digestive and genital systems;*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3恒河猴、非洲綠猴、食蟹猴PBMC中IL- 17RA和IL- 17RC mRNA水平比較 對三種猴PBMC中IL- 17RA的水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，恒河猴PBMC中IL- 17RA的水平最高，略高于其在小腸中的表達(dá)水平，食蟹猴PBMC中的IL- 17RA的水平約為恒河猴的1/3，而非洲綠猴PBMC中的IL- 17RA的水平最低，約為恒河猴的1/5，食蟹猴與非洲綠猴PBMC中的IL- 17RA水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但二者與恒河猴的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。另外，三種猴PBMC中均未檢測到IL- 17RC的表達(dá)。

圖2 IL- 17RC mRNA在恒河猴腸道組織中的分布Fig.2 Distribution of IL- 17RC mRNA in digestive tract of rhesus macaquesNote: Duo- p.Duodenum proximal；Jei- p.Jejunum proximal；Ile- d.Ileum distal；Cae.Caecum；Col- p.Colon proximal；Rec.Rectum;*.P<0.05.

圖3 恒河猴、非洲綠猴、食蟹猴PBMC中IL- 17RA mRNA水平的比較Fig.3 Comparison of IL- 17RA mRNA levels in PBMCs of rhesus macaque,African green monkey and cynomolgus monkeyNote: RhM.Rhesus macaque；AGM.African green monkey；CyM.Cynomolgus monkey;**.P<0.01.

3 討論

為闡明IL- 17RA在恒河猴中的分布特征，本研究檢測了包括免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等在內(nèi)的多種組織中IL- 17RA mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IL- 17RA mRNA在所檢測的組織中均有分布。在小鼠和人IL- 17R的研究中發(fā)現(xiàn)，IL- 17A可表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞等多種非造血系統(tǒng)細(xì)胞。由于這些細(xì)胞類型的分布大多沒有組織特異性，因此在不同組織均能檢測到IL- 17RA mRNA與預(yù)期結(jié)果相符。事實(shí)上，已有報(bào)道表明人和小鼠中IL- 17RA 的mRNA也具有廣泛的組織分布[9]。因此本研究表明恒河猴各組織中均有IL- 17A的表達(dá)，這與人和小鼠相似。

雖然在恒河猴的各器官系統(tǒng)中均有IL- 17RA的表達(dá)，但I(xiàn)L- 17RA mRNA的表達(dá)水平在各系統(tǒng)之間存在明顯的差異。與小鼠體內(nèi)的分布相似，IL- 17RA在恒河猴體內(nèi)主要分布在淋巴結(jié)、胸腺、骨髓、脾臟等造血器官，而在腸道、睪丸、心臟、肌肉等組織中水平較低。與小鼠體內(nèi)分布不同，恒河猴體內(nèi)IL- 17RA表達(dá)量最高的組織為淋巴結(jié)，其次為脾臟和胸腺，而小鼠體內(nèi)胸腺IL- 17RA表達(dá)水平最高，其次為脾臟，且這兩個組織中IL- 17RA的水平均在淋巴結(jié)的3倍以上[10]，表明IL- 17RA的組織分布在不同種屬之間可能存在差異。目前關(guān)于IL- 17RA在人體內(nèi)的分布情況研究較少， IL- 17RA能夠在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和皮膚成纖維細(xì)胞等人源細(xì)胞中表達(dá)，且在胃癌患者的癌組織中，IL- 17RA的表達(dá)水平是正常水平的4.8倍[13]，提示IL- 17RA的表達(dá)水平與機(jī)體病理生理狀態(tài)有關(guān)。

雖然各種動物之間IL- 17RA的分布存在差異，但各種動物中淋巴組織的IL- 17RA表達(dá)水平總體上都高于其他組織，這可能是因?yàn)榱馨徒M織是免疫細(xì)胞最集中(密度最高)的組織，而大多數(shù)類型的免疫細(xì)胞都表達(dá)IL- 17RA[9]。IL- 17/IL- 17R通路在消化道和呼吸道黏膜抗感染免疫和物理屏障維持中具有重要作用[16]。雖然恒河猴IL- 17RA mRNA在消化道中的平均水平低于淋巴組織，但由于腸道相關(guān)淋巴組織的免疫細(xì)胞超過其他所有淋巴組織的總和，因此腸道相關(guān)淋巴組織中表達(dá)的總的IL- 17RA仍然可能是最多的。

在恒河猴腸道黏膜中，大腸IL- 17RA和IL- 17RC mRNA水平均高于小腸。腸道黏膜中Th17細(xì)胞及其所分泌的IL- 17A、IL- 17F和IL- 22在抵抗病原菌侵襲中發(fā)揮了重要作用。研究表明，小鼠腸道內(nèi)存在的共生菌群可將未完全分化成熟的Th17細(xì)胞吸引到回腸末端，所以正常情況下體內(nèi)初始Th17細(xì)胞主要集中在大腸[17]，并在腸道微生物菌群的誘導(dǎo)下進(jìn)一步分化，這可能與IL- 17R在大腸和小腸中分布差異有一定關(guān)系。IL- 17RA在胰臟、肺臟及肝臟等內(nèi)臟器官也都有較高水平的表達(dá)，可能原因是IL- 17參與這些組織有關(guān)的疾病發(fā)展過程[18,19]。在肌肉中IL- 17R幾乎不表達(dá)，說明肌肉組織并非IL- 17發(fā)揮其生物學(xué)作用的主要場所。在生殖器官中，由于動物數(shù)量有限及個體差異，導(dǎo)致某些組織樣本量單一，在分析過程中可能造成誤差。

中國恒河猴和食蟹猴PBMC中IL- 17RA水平均明顯高于非洲綠猴。當(dāng)非洲綠猴感染猴免疫缺陷病毒(Simian immuondeficiency virus,SIV)后，機(jī)體在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生了抗病毒核心蛋白gag蛋白的抗體，導(dǎo)致系統(tǒng)免疫活化水平較低，病毒被控制在較低水平，感染個體并沒有明顯的臨床癥狀[20]，非洲綠猴在SIV感染后系統(tǒng)免疫活化水平低可能與IL- 17RA在PBMC中的低水平分布有關(guān)。三種猴PBMC中均未檢測到IL- 17RC，提示在正常生理?xiàng)l件下， PBMC中IL- 17RC可能處在一個極低的水平，當(dāng)受到IL- 6和IL- 23等炎性因子刺激后，IL- 17RC會在外周血中性粒細(xì)胞中迅速表達(dá)，與IL- 17RA共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程[21]。

本文對恒河猴正常組織中IL- 17R的分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)IL- 17RA在免疫系統(tǒng)中表達(dá)量最高，其次為生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)；IL- 17RC在大腸中的分布高于小腸；中國恒河猴和食蟹猴PBMC中IL- 17RA水平均明顯高于非洲綠猴。本研究為IL- 17相關(guān)人類疾病研究中動物模型的選擇提供了依據(jù)，為疾病過程中IL- 17R在組織中分布的變化及IL- 17相關(guān)生物學(xué)功能研究提供了基礎(chǔ)。

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