陳 健，柯逸暉，陳 彧，談偉君，程樹軍*(1.廣州市華代生物科技有限公司，廣州 5106； .廣東檢驗檢疫技術(shù)中心， 廣州 5106； .廣東藥科大學(xué)，廣州 510006)

接觸性過敏性皮炎(allergy contact dermatitis，ACD)是由T淋巴細胞介導(dǎo)的抗原特異性皮膚過敏反應(yīng)，以抗原刺激后局部皮膚出現(xiàn)一系列的皮膚炎癥細胞浸潤、炎癥介質(zhì)釋放為特征，屬于遲發(fā)IV型變態(tài)反應(yīng)。臨床主要表現(xiàn)為瘙癢、紅斑、紅腫等癥狀，對患者的正常生活和工作影響較大。日常生活中能引起ACD的物質(zhì)繁多，如化妝品、香精香料等，因此對這些物質(zhì)的致敏性檢測也顯得至關(guān)重要。法規(guī)認可的皮膚致敏檢測的動物實驗方法是豚鼠最大值試驗(guinea pig maximinatim test，GPMT)和封閉涂皮法(buchler test，BT)，后來，開發(fā)了小鼠局部淋巴結(jié)試驗(local lymph note assay，LLNA)，這些試驗需要大量動物，耗時長、成本高。隨著替代方法的興起，ACD發(fā)生過程與角質(zhì)細胞、樹突狀細胞和T細胞之間關(guān)系逐漸清晰，在有害結(jié)局通路(adverse outcome pathway，AOP)理論指導(dǎo)下，皮膚致敏替代方法研究取得了顯著的進步[1]，其中對于樹突狀細胞激活這一關(guān)鍵事件的研究最為活躍。

1 皮膚致敏的AOP理論與樹突狀細胞的關(guān)鍵作用

基于AOP理論，皮膚致敏的AOP通路可分為一個起始事件和三個關(guān)鍵事件(key event，KE)。分子起始事件(molecular initiating event，MIE)：具有親電作用的化學(xué)物質(zhì)與表皮蛋白質(zhì)的親核位點共價結(jié)合，形成半抗原。角質(zhì)細胞激活(KE1)：角質(zhì)細胞對半抗原-蛋白質(zhì)復(fù)合物的攝取，誘導(dǎo)炎性因子生成。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)激活(KE2)，DC攝取和呈遞抗原，未成熟的表皮DC識別半抗原蛋白復(fù)合物，表面特征性標(biāo)志物表達上升，同時釋放細胞因子，遷移至淋巴結(jié)，通過主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子將半抗原-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈遞給T細胞。T細胞活化/增殖(KE3)：T細胞識別細胞表面的MHC呈遞的抗原肽被激活形成記憶T細胞，當(dāng)皮膚再次接觸致敏原時，這些記憶T細胞就會增殖，誘發(fā)ACD。針對這些關(guān)鍵事件開發(fā)出不同機制的皮膚致敏的替代方法，其中直接肽鏈反應(yīng)分析(direct peptide reaction assay，DPRA)、KeratinoSens、U-SENSTM和人細胞系活化試驗(human cell line activation test，h-CLAT)已經(jīng)通過驗證，被經(jīng)濟合作和開發(fā)組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)接受為測試指南442C、442D和442E[2]。

在AOP通路中，DC作為機體功能最強的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，向上可以攝取呈遞抗原，向下可以活化T細胞，激活過敏免疫反應(yīng)，在AOP通路中作為關(guān)鍵事件2起到承上啟下的作用。其中，表皮和胃腸上皮中的DC又稱為朗格漢斯細胞(Langerhans cell，LC)，LC在活化成熟時，Ⅱ型MHC、共刺激分子(CD86、CD54、CD80和CD40)等表達上調(diào)。但由于原代樹突狀細胞在誘導(dǎo)分化和提純方面存在很大困難，因此有研究選用具有相同性質(zhì)的類樹突狀細胞如THP-1細胞、U937細胞等來開發(fā)替代方法。

2 基于KE2的體外方法

2.1 h-CLAT體外致敏檢測方法

THP-1細胞是一類單核細胞，與LC功能相似，實驗中不需要誘導(dǎo)分化就能準(zhǔn)確判斷出化合物的致敏性，大量研究發(fā)現(xiàn)THP-1細胞相比其他單核細胞更穩(wěn)定，準(zhǔn)確率更高。使用THP-1細胞構(gòu)建的h-CLAT方法于2016年被OECD列為測試指南442E。實驗時先測定受試物的細胞毒性，確定75%細胞活率濃度，再將THP-1細胞暴露受試物24 h，通過流式細胞儀檢測CD86和CD54的表達，對受試物致敏性進行判斷。陳彧等[3]采用h-CLAT方法，對11種已知成分化學(xué)物質(zhì)和9種未知植物樣品和日用產(chǎn)品進行預(yù)測，準(zhǔn)確區(qū)分了11種已知參考物質(zhì)的皮膚致敏性，對9種未知樣品的分類結(jié)果與動物實驗結(jié)果一致。Sakaguchi等[4]也使用同樣的方法對8種防腐劑的皮膚致敏性進行了評價。Parise等[5]在分析23種物質(zhì)致敏性時發(fā)現(xiàn)，細胞表面標(biāo)志物CD86表達情況和細胞炎性因子白介素8(interleukin-8，IL-8)釋放量之間存在正相關(guān)，說明IL-8也可以作為鑒別化學(xué)物質(zhì)致敏性的指標(biāo)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)釋放量與受試物致敏性之間存在關(guān)聯(lián)。Ashikaga等[6]研究發(fā)現(xiàn)在THP-1細胞，能觀察到致敏暴露組CD86與MHC Ⅱ類分子的表達較非致敏組明顯上升，提示CD86、MHC Ⅱ類分子可能是區(qū)分致敏物與刺激物的敏感指標(biāo)。研究表明，h-CLAT在預(yù)測親脂性物質(zhì)致敏性時靈敏度和準(zhǔn)確度分別為95%和88%[7]。

2.2 U-SENSTM體外致敏檢測方法

U937細胞是來源于人體骨髓系的單核細胞，在細胞被活化后其表面標(biāo)志物CD86會特異性上升，因此該細胞也可用于模擬DC細胞激活引起T細胞增殖的關(guān)鍵步驟。U-SENSTM就是基于該細胞系建立的體外致敏檢測方法，將受試物與U937細胞共孵育后，定量檢測細胞表面標(biāo)志物CD86表達的變化，從而對受試物致敏性進行判斷。Alépée等[8]報道4個實驗室使用U-SENSTM方法對24種物質(zhì)的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該方法的實驗室內(nèi)可重復(fù)性約為90%，實驗室間重復(fù)性為84%。對24種受試物進行預(yù)測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度均高于93.8%。Piroird等[9]通過將175種物質(zhì)的U-SENSTM評價結(jié)果與人體數(shù)據(jù)和LLNA試驗結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)U-SENSTM的特異性為79%，靈敏度為90%，準(zhǔn)確度為85%。與h-CLAT方法相比，檢測參數(shù)只有CD86，可以作為組合測試策略的一部分。該方法在2017年作為補充方法列入OECD測試指南OECD442E。

2.3 外周血單核細胞試驗

外周血單核細胞(peripheral blood monocyte-derived cell，PBMDC)是從新鮮血沉棕黃層中分離得到的單核細胞，使用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)分化形成CD1a-/CD14+單核細胞。在暴露于受試物48 h后，根據(jù)細胞表面CD86的表達情況判斷受試物致敏性。Karschuk等[10]使用誘導(dǎo)的CD1a-/CD14+單核細胞對受試物的致敏性進行了分析，發(fā)現(xiàn)相比于刺激性化學(xué)物和非致敏性化學(xué)物質(zhì)，致敏性化學(xué)物會特異性使細胞CD86表達增加，而CD83與人白細胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)則不明顯，提示在PBMDC實驗中，同樣選擇了CD86作為評價受試物致敏性的特異性指標(biāo)。但細胞供體來源不穩(wěn)定，細胞需要誘導(dǎo)分化。

2.4 VITOSENS?試驗

VITOSENS?試驗使用來自人臍帶血分化的CD34+祖細胞來對受試物致敏性進行檢測，在與受試物共孵育后，通過比較暴露組與溶劑組中趨化因子2型受體(chemokine receptor type 2，CCR2)和cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)因子(camp responsive element modulator，CREM)的表達來判斷受試物致敏性。將細胞暴露于受試物24 h后，使用流式細胞儀測定受試物的IC20值。然后以測定的IC20為最低暴露劑量，孵育6 h取部分細胞通過qPCR分析相關(guān)基因的表達，孵育24 h后收集全部細胞，使用qPCR測定細胞CCR2和CREM表達情況。Hooyberghs等[11]通過對10種致敏物和11種非致敏物進行檢測，使用RT-PCR分析基因表達情況，發(fā)現(xiàn)致敏組基因CREM和CCR2的表達均顯著高于非致敏組(P< 0.05)。Lambrechts等[12]使用該方法對15種已知致敏性化學(xué)物進行預(yù)測。實驗中需要使用qPCR技術(shù)，實驗成本相對其他體外替代方法較高，且不同來源的CD34+祖細胞也會影響到實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

2.5 基因組過敏原快速檢測方法

MUTZ-3是人類急性骨髓單核細胞白血病細胞系，其在免疫反應(yīng)中具有激活特異性T細胞的能力，并且在成熟過程中也其細胞相關(guān)表型變化也與DC相似，能夠表達CD1a、HLA-DR和CD54，同時還能低表達CD80和CD86。利用MUTZ-3細胞在免疫反應(yīng)中的特性建立了體外致敏預(yù)測的基因組過敏原快速檢測方法(genomic allergen rapid detection，GARD)。Johansson等[13]在研究使用20種非致敏物和20種致敏物刺激MUTZ-3，共孵育24 h后，通過對MUTZ-3細胞的基因表型進行分析，確定了200個相關(guān)基因的表達與受試物致敏性存在相關(guān)性，也提示該方法在有能力對受試物的致敏性進行預(yù)測。但該方法與VITOSENS?相似，檢測成本比較高。

3 以KE2為核心建立組合模型和方法

類樹突狀細胞作為免疫細胞能夠單獨用來檢測化學(xué)物質(zhì)致敏性，但作為體外系統(tǒng)的單細胞體系，在評價化合物致敏性時會因為系統(tǒng)代謝機能不足，對于一些小分子物質(zhì)或者半抗原類物質(zhì)還存在缺陷。同時，細胞活率對細胞表面標(biāo)志物的表達有很大影響，為了改善這種情況，基于單細胞體系的致敏檢測系統(tǒng)做出了改良。

3.1 THP-1細胞與角質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型

角質(zhì)形成細胞除了構(gòu)成皮膚的屏障功能，還能通過代謝功能對外源受試物進行處理，并產(chǎn)生和釋放炎性因子，同時也可對半抗原或半抗原前體物進行修飾、活化和蛋白結(jié)合。在皮膚致敏感的AOP理論中，角質(zhì)形成細胞激活是KE1?；诮琴|(zhì)細胞活化的方法可用于篩選致敏物，但由于其并非專職的抗原提呈細胞，因此使用正常角質(zhì)細胞的測試方法通常預(yù)測能力較弱，可以通過對細胞進行基因修飾轉(zhuǎn)染抗氧化元件(如KeratinoSens方法)以提高其敏感性，或者與其它方法組合使用。

Hennen等[14]通過將HaCaT與THP-1細胞聯(lián)合培養(yǎng)來探討共培養(yǎng)體系在預(yù)測化學(xué)物致敏性中的優(yōu)勢。單獨培養(yǎng)HaCaT 48 h后，加入受試物和THP-1細胞共培養(yǎng)24 h，分析細胞表面標(biāo)志物CD86、CD40和CD54的表達，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中THP-1細胞表面標(biāo)志物的表達量顯著增加。并且在實驗中發(fā)現(xiàn)，使用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測化學(xué)物致敏性時，THP-1細胞表面標(biāo)志物的表達不受細胞活率影響。使用CD86作為生物標(biāo)志物時，共培養(yǎng)體系還可以用來區(qū)分半抗原物質(zhì)和半抗原前體物質(zhì)。這些研究成果對體外致敏評價技術(shù)的發(fā)展提供了很好的基礎(chǔ)。近來，Hennen等[15]使用共培養(yǎng)方法正確區(qū)分了14種致敏物和9種非致敏物，說明共培養(yǎng)體系能提高致敏檢測的靈敏度和特異性。采用靜態(tài)的兩種細胞的共培養(yǎng)模型不僅可用于研究角質(zhì)細胞與THP-1細胞產(chǎn)生致敏反應(yīng)的機制，還有助于探討細胞間的相互作用。

3.2 THP-1細胞與皮膚模型共培養(yǎng)模型

盡管共培養(yǎng)體系能夠提升體外致敏檢測試驗的靈敏度和特異度，但在處理難溶或不溶性物質(zhì)時，仍然存在很大的缺陷。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程皮膚也逐漸被應(yīng)用到化學(xué)品的安全評價中，如普遍使用的商品化皮膚模型EpiskinTM、EpidermTM和SkinEthie RHE。皮膚模型經(jīng)刺激物或變應(yīng)原處理后會出現(xiàn)細胞活力改變、組織學(xué)改變以及細胞因子釋放等，可通過有效手段進行檢測，但是單獨皮膚模型不能模擬復(fù)雜的生物代謝過程，并且沒有免疫細胞參與，可能無法對待測物進行有效預(yù)測。Cao等[16]使用分離的原代角質(zhì)形成細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后分化形成組織工程表皮，將THP-1細胞與組織工程表皮共培養(yǎng)24 h后，將質(zhì)量濃度2 g/L DNFB和10 g/L SDS分別取5 μL均勻涂抹于構(gòu)建的組織工程表皮表面，孵育24 h。孵育完成后使用流式細胞儀分析細胞表面標(biāo)志物CD86和CD54的活化情況，使用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中白細胞介素1β的水平。結(jié)果DNFB處理組中，THP-1細胞表面標(biāo)志物CD86和CD54表達量顯著增加，而在SDS處理組中則未觀察到此現(xiàn)象，提示該檢測模型能用來預(yù)測化學(xué)物致敏性。

3.3 含LC的皮膚模型

含免疫細胞的皮膚模型的構(gòu)建有一定的技術(shù)難度，文獻報道了一種含有功能性LC細胞的皮膚模型，采用MUTZ-3來源的LC細胞，以模擬人體皮膚的方式局部接觸抗原或刺激物，可以啟動固有的免疫應(yīng)答[17]。模型開發(fā)的下一步是引入T細胞，用于研究獲得性免疫反應(yīng)。把含LC細胞的皮膚模型與T細胞共培養(yǎng)，可以實現(xiàn)把AOP通路中三個關(guān)鍵事件的整合成一個實驗系統(tǒng)。

3.4 皮膚致敏芯片

THP-1細胞與HaCaT細胞，或者與皮膚模型的共培養(yǎng)模型，是一種靜態(tài)水平的研究兩種或多種細胞間相互作用的模型。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，小型化、高通量的模擬人體皮膚血液流動的動態(tài)環(huán)境的裝置被開發(fā)出來，利用這種皮膚致敏感芯片系統(tǒng)，可實現(xiàn)將THP-1細胞與角質(zhì)細胞或者皮膚模型動態(tài)連接起來，使用計算機進行精確控制、微量加樣和實時檢測相關(guān)參數(shù)。對于精確研究低致敏物質(zhì)的量效關(guān)系、模擬生理狀態(tài)下細胞之間的交叉對話(cross-talking)，深入了解細胞表面標(biāo)志物、炎性因子釋放和基因組的調(diào)控提供了理想的模型。目前，使用皮膚模型與皮膚附屬器或機體其它細胞組合的人體芯片研究已經(jīng)開始[18]。

4 結(jié)論與展望

隨著ACD機制的逐漸被闡明，基于AOP通路中KE2開展的研究和建立的體外致敏檢測方法越來越多，更多的方法經(jīng)過驗證被用于指導(dǎo)化學(xué)品、藥品或其它物質(zhì)皮膚致敏的檢測。目前，基于樹突狀細胞的方法在研發(fā)和使用時應(yīng)注意以下幾個問題：①選擇接近體內(nèi)樹突細胞的細胞系：目前用于KE2檢測的細胞種類較多，要根據(jù)研究需要尋找和選用不同的細胞；②了解檢測方法所依賴的細胞系的局限性和適用性：如THP-1與U-973的細胞表面標(biāo)志物類型和強弱不同，使用時應(yīng)記錄其表型特征，并建立細胞質(zhì)量控制檔案；③使用組合方法：實驗室應(yīng)建立AOP通路中的至少3個方法，并根據(jù)整合測試策略(integrated approaches to testing assessment，IATA)的原則建立整合模型，以提高致敏預(yù)測的準(zhǔn)確性；④建立體外數(shù)據(jù)庫：皮膚致敏體外方法的開發(fā)處于推廣和數(shù)據(jù)積累階段，實驗室應(yīng)積累不同化學(xué)品原料的測試數(shù)據(jù)，反過來對方法進行優(yōu)化；⑤合理推廣應(yīng)用范圍：體外方法的開發(fā)主要是根據(jù)單一化學(xué)品的測試建立模型，實際應(yīng)用中可能用于醫(yī)療器械浸提物、植物提取物、混合物等復(fù)雜樣品的測試，應(yīng)在使用中積累經(jīng)驗，合理推廣替代方法的使用范圍，必要時與其它方法互相驗證[19]。相信，在AOP通路的指導(dǎo)下，皮膚致敏的體外方法開發(fā)將朝著進一步降低實驗成本、提高預(yù)測準(zhǔn)確性、使用組合模型和提高檢測通量的方向發(fā)展。成套和標(biāo)準(zhǔn)化替代方法的開發(fā)，在豐富毒性測試檢測工具箱的同時，進一步減少了動物的使用，也起到了提高消費品安全的作用。

參考文獻：

[1] 瞿小婷, 程樹軍, 秦瑤, 等. 有害結(jié)局通路指南及毒性測試應(yīng)用分析 [J]. 日用化學(xué)工業(yè), 2016, 46(8): 473-478.

[2] 程樹軍. 化妝品評價替代方法標(biāo)準(zhǔn)實施指南 [M]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2017.

[3] 陳彧, 喻歡, 秦瑤, 等. 基于THP-1細胞的皮膚致敏體外檢測方法 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 27(4): 94-102.

[4] Sakaguchi H, Miyazawa M, Yoshida Y, et al. Prediction of preservative sensitization potential using surface marker CD86 and/or CD54 expression on human cell line, THP-1 [J]. Arch Dermatol Res, 2007, 298(9): 427-437.

[5] Parise CB, Sá-Rocha VM, de Moraes JZ. Skin sensitizer identification by IL-8 secretion and CD86 expression on THP-1 cells [J]. Toxicol In Vitro, 2015, 30(1): 318-324.

[6] Ashikaga T, Hoya M, Itagaki H, et al. Evaluation of CD86 expression and MHC class II molecule internalization in THP-1 human monocyte cells as predictive endpoints for contact sensitizers [J]. Toxicol In Vitro, 2002, 16(6): 711-716.

[7] Takenouchi O, Miyazawa M, Saito K, et al. Predictive performance of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for lipophilic chemicals with high octanol-water partition coefficients [J]. J Toxicol Sci, 2013, 38(4): 599-609.

[8] Alépée N, Piroird C, Aujoulat M, et al. Prospective multicentre study of the U-SENS test method for skin sensitization testing [J]. Toxicol In Vitro, 2015, 30(1): 373-382.

[9] Piroird C, Ovigne JM, Rousset F, et al. The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization [J]. Toxicol In Vitro, 2015, 29(5): 901-916.

[10] Karschuk N, Tepe Y, Gerlach S, et al. A novelinvitromethod for the detection and characterization of photosensitizers [J]. PLoS One, 2010, 5(12): S58.

[11] Hooyberghs J, Schoeters E, Lambrechts N et al. A cell-basedinvitroalternative to identify skin sensitizers by gene expression [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 231(1): 103-111.

[12] Lambrechts N, Nelissen I, Tendeloo VV, et al. Functionality and specificity of gene markers for skin sensitization in dendritic cells [J]. Toxicol Lett, 2011, 203(2): 106-110.

[13] Johansson H, Albrekt AS, Borrebaeck CA, et al. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers [J]. Toxicol In Vitro, 2013, 27(3): 1163-1169.

[14] Hennen J, Aeby P, Goebel C, et al. Cross talk between keratinocytes and dendritic cells: impact on the prediction of sensitization [J]. Toxicol Sci, 2011, 123(2): 501-510.

[15] Hennen J, Bl?meke B. Keratinocytes improve prediction of sensitization potential and potency of chemicals with THP-1 cells [J]. Altex, 2017, 34(2): 279-288.

[16] Cao YP, Ma PC, Liu WD, et al. Evaluation of the skin sensitization potential of chemicals in THP-1/keratinocyte co-cultures [J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2012, 34(2): 196-204.

[17] Kosten IJ, Spiekstra SW, DeGruij TD, et al. MUTZ-3 derived Langerhans cells in human skin equivalents show differential migration and phenotypic plasticity after allergen or irritant exposure [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2015, 287(1): 35-42.

[18] Ramadan Q, Ting FC.Invitromicro-physiological immune-competent model of the human skin [J]. Lab Chip, 2016, 16(10): 1899-1908.

[19] Coleman KP, McNamara LR, Grailer TP, et al. Evaluation of aninvitrohuman dermal sensitization test for use with medical device extracts [J]. Appl In Vitro Toxicol, 2015, 1(2): 13.