劉雅萍，李鴻雁，鄭 莉，常 明，李 斌，金青哲，王興國(.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 4； .沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，沈陽 0866)

樹莓(RubuscorchorifoliusL.f.)，又名馬林、木莓、托盤，是薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物，為多年生落葉性灌木型果樹，適應(yīng)性極強(qiáng)[1]。樹莓在國際市場上被譽(yù)為“黃金水果”，不僅其果肉口感良好，柔嫩多汁，香味獨特，而且含有大量的功能因子[2]，尤其樹莓籽油中含有大量的不飽和脂肪酸及人體必需的脂肪酸，其中亞油酸、亞麻酸、油酸等不飽和脂肪酸含量較高[3]。現(xiàn)國內(nèi)外雖對懸鉤子屬植物研究較多，但總體來講對樹莓的報道較少，且報道之間存在較大差異，絕大部分都集中在栽培、加工和推廣上，并沒有做系統(tǒng)的研究[4-8]。了解脂肪酸的組成對樹莓籽油的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義，而脂肪伴隨物，如植物甾醇、生育酚、多酚等，因其特有的對人體有很多有益的功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)[9]。本試驗采用超臨界CO2法萃取樹莓籽油，并對樹莓籽油的脂肪酸及脂肪伴隨物成分進(jìn)行分析與探討，旨在為樹莓產(chǎn)業(yè)鏈的延伸提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

樹莓(市場購入)，正己烷、甲醇、乙酸乙酯、95%乙醇、氫氧化鉀、無水乙醚、無水乙醇、抗壞血酸、無水硫酸鈉、無水碳酸鈉，均為分析純；福林酚試劑；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%；生育酚標(biāo)準(zhǔn)品；甾醇內(nèi)標(biāo)(5α-膽甾烷醇)；BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化試劑，購于美國Sigma公司；19-羥基膽固醇(純度>98%)，購于美國Steraloids公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超臨界CO2萃取設(shè)備，美國Waters公司；Trace GC Ultra氣相色譜儀；ISQ質(zhì)譜檢測儀；AR2140型電子分析天平；Al3000型自動進(jìn)樣器，美國Thermo公司；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Anke TGL-16G型臺式離心機(jī)；ZK-82BB型電熱真空干燥箱；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋；安捷倫1260高效液相色譜儀；Diol-SPE固相萃取柱(填料為二乙醇基)；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；723型紫外可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 樹莓籽油的制取

樹莓去皮去果肉后得到樹莓籽，清洗烘干，粉碎過60目篩后，取樹莓籽粉115.00 g，裝柱密封，安裝并調(diào)試超臨界萃取設(shè)備，設(shè)置參數(shù)，萃取溫度40℃，壓力300 MPa，CO2流速40 g/min，萃取時間100 min。萃取結(jié)束，收集產(chǎn)物樹莓籽油。經(jīng)兩次平行試驗分別得到樹莓籽油20.097 4、20.977 8 g，出油率為17.90%±0.3%。

1.2.2 樹莓籽油脂肪酸組成測定

1.2.2.1 樣品前處理

參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行甲酯化處理。

1.2.2.2 GC條件

PEG-20000毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為初始溫度80℃保持3 min，以10℃/min升至220℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比50∶1；載氣為氮氣(99.999%)；燃燒氣為氫氣(99.999%)和空氣；檢測器溫度250℃；氫氣壓力60 kPa；空氣壓力50 kPa；柱前壓220 kPa。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品確定脂肪酸的種類，并利用峰面積歸一化法計算相應(yīng)脂肪酸含量。

1.2.3 樹莓籽油甾醇測定

1.2.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樹莓籽油0.200 g置于50 mL離心管，加入0.5 mL質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的5α-膽甾烷醇作為內(nèi)標(biāo)，隨后加入3 mL 2 mol/L KOH-乙醇溶液，85℃水浴加熱1 h，取出冷卻至室溫后加入2 mL 水和5 mL正己烷，離心提取上層清液，并對下層用5 mL正己烷重復(fù)提取兩次，合并有機(jī)液，加入2 mL水，振蕩后提取上清液于15 mL離心管，利用氮氣吹干，加入BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化試劑200 μL，放置于75℃水浴30 min。取出冷卻后，過0.22 μm有機(jī)膜，待GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS條件

DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為初始溫度200℃保持0.5 min，以10℃/min升至300℃，保持18 min；進(jìn)樣口溫度280℃；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比100∶1；載氣為氦氣(99.99%)，流速1.2 mL/min；離子源溫度250℃；傳輸線溫度280℃；EI離子化模式；分子離子碎片掃描范圍(m/z)50～550。

1.2.4 樹莓籽油生育酚測定

1.2.4.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.500 g樹莓籽油于皂化瓶中，加入30 mL無水乙醇，振蕩后加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的抗壞血酸和10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的KOH溶液，混勻后立即置于沸水浴回流50 min，取出后放入冰水中冷卻。轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分別用50 mL水、100 mL乙醚各洗滌2～3次皂化瓶，輕微振搖后靜置1 min，棄去下層，繼續(xù)加水洗滌，至下層流出的水不呈堿性停止萃取。將上層溶液用無水Na2SO4過濾并轉(zhuǎn)入蒸發(fā)瓶，加入少量乙醚洗滌無水Na2SO4及分液漏斗2～3次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃水浴中減壓蒸餾 5 min，再用氮氣吹掉乙醚，立即加入2.00 mL乙醇溶解，將溶解物轉(zhuǎn)移到5 mL離心管，于10 000 r/min，離心5 min，取上清液過0.22 μm膜，待HPLC分析。

1.2.4.2 HPLC條件

Sehperisorb Silica色譜柱(25 cm×4.6 mm×5 μm)；柱溫30℃；檢測波長295 nm；流動相為正己烷-異丙醇(體積比98.5∶1.5)；流速1 mL/min。

1.2.5 樹莓籽油多酚測定

分別用6 mL甲醇和6 mL正己烷過SPE柱使其活化。稱取樹莓籽油1.500 g，將樣品溶于6 mL正己烷中過柱，再分兩次用3 mL正己烷洗SPE柱，加入4 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比9∶1)過柱，后加入甲醇洗脫并收集洗脫液，將洗脫液轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，后移取5 mL置于另1個10 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚反應(yīng)3 min，再加入1 mL 10%的Na2CO3溶液，用水定容，暗反應(yīng)2 h，過0.45 μm膜。用紫外可見分光光度計于765 nm波長下檢測其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.062 3x+0.042 7)計算多酚含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹莓籽油脂肪酸組成

經(jīng)過GC檢測分析，確定了樹莓籽油的脂肪酸組成及相對含量，結(jié)果見表1。

表1 樹莓籽油中脂肪酸組成及相對含量

從表1可以看出，樹莓籽油中共檢測到10種脂肪酸，其中有7種不飽和脂肪酸，含量高達(dá)96.99%，以亞油酸含量(57.44%)最高，其次是α-亞麻酸(26.58%)、油酸(11.94%)。亞油酸是最早被確認(rèn)的必需脂肪酸，是一種在人體發(fā)揮重要作用的多不飽和脂肪酸，不但具有降血脂作用，而且具有很高的抗癌活性、增強(qiáng)胰島素、增強(qiáng)免疫力、減肥等功效[11]。α-亞麻酸能夠轉(zhuǎn)化為人體必需的DHA、EPA[12]，是一種優(yōu)良的不飽和脂肪酸。

2.2 樹莓籽油甾醇組成

經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索及文獻(xiàn)對照，確定出樹莓籽油中甾醇類化合物組成，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，樹莓籽油中除含有β-谷甾醇、環(huán)阿屯醇、豆甾醇、羊毛甾醇和菜油甾醇外，還含有其他多種甾醇化合物。β-谷甾醇和豆甾醇是比較常見的植物甾醇，主要存在于植物的根、莖、葉、果實和種子中，具有降血脂、抗癌、抗炎癥等功效[13]。本試驗測得菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、環(huán)阿屯醇、24-亞甲基環(huán)阿屯醇、其他甾醇分別占總甾醇含量的3.38%、1.28%、76.95%、2.72%、2.80%、6.26%、6.61%。樹莓籽油中總甾醇含量達(dá)861.85 mg/100 g，高于大豆油、大蒜油、花生油、茶油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、橄欖油、葡萄籽油、姜油、花椒油、辣椒油、芥末油中的含量[14-15]。

表2 樹莓籽油中甾醇類化合物組成

2.3 樹莓籽油生育酚組成(見表3)

表3 樹莓籽油中生育酚組成及含量 mg/kg

從表3可以看出，在生育酚的3種異構(gòu)體中，γ-生育酚的含量最高，達(dá)到799.248 mg/kg，其次是α-生育酚和δ-生育酚含量，分別為602.996 mg/kg和13.371 mg/kg。總生育酚含量尤其是γ-生育酚含量均高于橄欖油、葵花籽油、核桃油、菜籽油、亞麻籽油、葡萄籽油、芥花籽油、花生油、玉米油、米糠油、芝麻油和大豆油中的含量[16-18]。

2.4 樹莓籽油多酚含量

根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。得出樹莓籽油中多酚平均含量為(341.19±8.94)mgGAE/kg，高于初榨橄欖油中的含量[19]。

3 結(jié) 論

對超臨界CO2技術(shù)萃取制得到的樹莓籽油的脂肪酸和脂肪伴隨物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：樹莓籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)95%以上，主要是亞油酸(57.44%)、α-亞麻酸(26.58%)和油酸(11.94%)；同時，樹莓籽油中含有豐富的β-谷甾醇，含量可達(dá)663.22 mg/100 g；生育酚中γ-生育酚和α-生育酚較多，含量分別達(dá)到799.248 mg/kg和602.996 mg/kg；多酚平均含量為(341.19±8.94)mgGAE/kg。樹莓籽油中各種脂肪酸、甾醇、生育酚、多酚等成分相互影響，協(xié)同作用，共同發(fā)揮其重要的營養(yǎng)功能和降低血清膽固醇含量、增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性、抗氧化等保健功能，符合現(xiàn)代人對健康天然的追求，使樹莓籽油具有巨大市場前景。此外，本研究也有助于后續(xù)深入研究樹莓籽油的營養(yǎng)保健功能及提取技術(shù)。

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