饒犇+周榮華+閔勇+廖先清+劉芳+陳偉

摘要：為了得到棘孢木霉（Trichoderma asperellum）發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，應用Plackett-Burman設計法對影響棘孢木霉菌絲體產(chǎn)量的關鍵因子進行了篩選，并進一步采用響應面分析法對影響菌絲產(chǎn)量的關鍵因素最佳水平進行了研究。結(jié)果表明，影響棘孢木霉菌絲體產(chǎn)量的關鍵因素為硝酸銨和硫酸鎂的濃度。通過響應面分析法的擬合和推算，得到在硝酸銨和硫酸鎂濃度分別為1.7 g/L和1.43 g/L時，模型預測發(fā)酵最佳產(chǎn)量為0.85 g/mL，驗證值為0.905 g/mL，預測值與驗證值之間吻合較好，約是原始培養(yǎng)基產(chǎn)量的2倍。

關鍵詞：棘孢木霉（Trichoderma asperellum）；Plackett-Burman設計法；響應面分析法

中圖分類號：Q939.96；Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4531-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.028

Abstract： In order to obtain the optimal medium composition for Trichoderma asperellum production， the Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of seven variables，and the optimum levels of key factors affecting mycelium yield were conducted by response surface analysis methodology. The results showed that，the optimal values of the two parameters determined by response surface analysis methodology were ammonium nitrate 1.7 g/L and magnesium sulfate 1.43 g/L. The mycelium production was 0.85 g/mL，and the actual experimental result was 0.905 g/mL， they were in agreement and it is about two folds of the production before optimization.

Key words： Trichoderma asperellum； Plackett-Burman； response surface analysis methodology

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）能夠抑制多種病原菌，促進植物生長，誘導作物的免疫能力，而且能降解土壤中鹽類化合物、農(nóng)藥殘留等，因而被廣泛應用于農(nóng)林業(yè)中。早在20世紀80年代，歐洲國家就開始了棘孢木霉制劑的商品化生產(chǎn)，如今棘孢木霉作為生物防治微生物已經(jīng)得到了廣泛的應用。長期以來，中國登記的棘孢木霉制劑質(zhì)量較差，貨架期很短，在一定程度上影響了推廣使用，因此，研究高產(chǎn)棘孢木霉的液體發(fā)酵條件尤為重要。

試驗利用響應面法對棘孢木霉發(fā)酵的關鍵因素進行了優(yōu)化。從Plackett-Burman試驗可以得知，硝酸銨和硫酸鎂對棘孢木霉的菌絲產(chǎn)量影響顯著，所以利用響應面試驗設計以這兩個因素為自變量，以棘孢木霉菌絲量為響應值，通過Minitab 15軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，建立多元二次回歸方程，利用方差分析模型和各因子的顯著性獲得棘孢木霉液體發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)，以期為棘孢木霉制劑的開發(fā)提供參考[1-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1）菌株。棘孢木霉由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心生物技術研究室分離保存，能夠拮抗多種植物病害，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

2）培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，2%瓊脂；種子培養(yǎng)基（g/L）：PDA培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖5，玉米粉8，硝酸銨2，豆粕3，硫酸鎂1，磷酸二氫鉀1，后期采用優(yōu)化后的配方。

1.2 方法

1）發(fā)酵培養(yǎng)條件。接種體積分數(shù)5%，發(fā)酵溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵96 h。

2）Plackett-Burman試驗。采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養(yǎng)基成分進行考察，篩選影響棘孢木霉生物量的重要因素，確定最佳配方。設計水平和排列方式見表1。

3）最陡爬坡試驗。根據(jù)Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長，另外步長確定亦與試驗條件相關。

4）中心組合設計和響應面分析。對Plackett-Burman試驗確定的因素，以最陡爬坡試驗得到的中心點，根據(jù)中心組合設計原理安排響應面試驗獲得重要因素的最佳配方水平。根據(jù)中心組合設計結(jié)果來擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

Y=b0+■bixj+■■bijxixj+■biix2i+e

式中，Y為產(chǎn)物能力測量值，b0為截距，bi為關鍵因素線性效果的系數(shù)，bii為關鍵因素的二次效應的系數(shù)，bij為關鍵因素間交互作用的系數(shù)。

根據(jù)擬合的數(shù)學模型以及方差分析結(jié)果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時利用擬合的數(shù)學方程求解最優(yōu)的結(jié)果。

5）培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗證試驗。用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的菌絲質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

據(jù)前期研究結(jié)果，確定以蔗糖和玉米粉為碳源，以硝酸銨和豆粕為氮源，并和其他幾種無機鹽共7種因素（X1：蔗糖，X2：玉米粉，X3：硝酸銨，X4：豆粕，X5：硫酸鎂，X6：磷酸二氫鉀，X7：磷酸氫二鉀）一起進行Plackett-Burman設計試驗，設計方案和試驗結(jié)果見表1。

由t檢驗結(jié)果可知，硝酸銨和硫酸鎂對棘孢木霉的菌絲生長具有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對棘孢木霉的菌絲生長影響是負效應。

由上述Plackett-Burman試驗得到的回歸方程如下：

Y=53.54-4.393 X1-1.834 X2-5.239 X3-1.098 X4-1.25 X5-1.989 X6-4.264 X7，方程擬合的相關性為R2=0.953 4，表明此多項式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman的試驗結(jié)果。

2.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

找到對產(chǎn)物發(fā)酵影響最大的因素后，需要進一步對這些因素進行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman設計試驗得到的一次方程為基礎，以相應因素的系數(shù)比為基準進行步移，直到步移至最高點，然后以最高點附近的范圍作為響應面優(yōu)化的相應范圍。從Plackett-Burman設計試驗得到方程中硝酸銨和硫酸鎂的系數(shù)（X1∶5.239，X2∶1.25），可以得這兩個因素步移的步長比為1∶0.24，即當硝酸銨步移1個單位（0.5 g/L）時，硫酸鎂步移0.24個單位（0.12 g/L）。以Plackett-Burman設計中的中心點作為步移的起點，試驗設計與試驗結(jié)果見表2。從表2可以看出，棘孢木霉菌絲體的產(chǎn)量在步移進行至第三步時達到最高點，之后棘孢木霉菌絲體產(chǎn)量開始下降。步移最高點時硝酸銨和硫酸鎂的濃度分別為1.0、1.26 g/L，這一點被用作下一步響應面分析的中心點。

2.3 中心組合設計試驗結(jié)果

根據(jù)以上兩水平Plackett-Burman試驗可知，影響棘孢木霉生物量的兩個重要因素分別是硝酸銨和硫酸鎂。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，試驗設計及結(jié)果見表3，共13組試驗。

以硝酸銨和硫酸鎂為自變量，以棘孢木霉的菌絲濕重為響應值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項式回歸方程為Y=-69.352 0+0.789 2 X1-9.699 X2-1.279 1 X12+8.070 9 X22 +12.342 5 X1X2，Y為響應值，X1為硝酸銨，X2為硫酸鎂。利用Minitab軟件響應優(yōu)化器進行計算可得，最大值處X1=1.7 g/L，X2=1.43 g/L，在此條件下理論預測得到的菌絲濕重值為0.85 g/mL。

2.4 最佳培養(yǎng)基的驗證

為了確定試驗結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進行了驗證試驗，共進行了3組平行試驗，結(jié)果表明，棘孢木霉的菌絲體產(chǎn)量為0.905 g/mL，與預測值十分接近。

3 小結(jié)

對棘孢木霉生長培養(yǎng)基進行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方：蔗糖10 g/L，玉米粉10 g/L，硝酸銨1.7 g/L，豆粕5 g/L，硫酸鎂1.43 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L。在此條件下，棘孢木霉的菌絲體理論最高產(chǎn)量為0.85 g/mL，驗證試驗中最高值為0.905 g/mL，與理論預測相符，約是優(yōu)化前實際產(chǎn)量（0.44 g/mL）的2倍。

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