鄧俊才 ，楊才瓊 ，2，吳海軍 ，2，楊文鈺 ，劉 江 ，2*

（1.農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，成都 611130）

黑豆種皮抗田間霉菌活性成分的分離純化與鑒定

鄧俊才1，楊才瓊1，2，吳海軍1，2，楊文鈺1，劉 江1，2*

（1.農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，成都 611130）

【目的】通過分離、純化和鑒定黑豆種皮中的主要化學(xué)成分，對其田間霉菌抑制活性進行系統(tǒng)評價?！痉椒ā恳砸志钚詾橹笇?dǎo)，采用液相萃取、硅膠柱層析等方法，分離純化黑豆種皮醇提物中的化學(xué)成分，結(jié)合核磁共振波譜（NMR）數(shù)據(jù)鑒定抑菌化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；并采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）對黑豆種皮中花色苷組分進行定量分析?！窘Y(jié)果】黑豆種皮抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取層，從中純化得到主要活性成分表兒茶素，其對黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、黑曲霉菌（Aspergillus nige）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）和產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum）具有明顯的抑制作用。定量分析結(jié)果表明，黑豆種皮中富含矢車菊素葡萄糖苷等花色苷類物質(zhì)，其在提取過程中可轉(zhuǎn)化形成表兒茶素。【結(jié)論】表兒茶素作為黑豆種皮中多酚類物質(zhì)的重要組成成分，具有較強的抑菌活性，是黑豆抗田間霉菌的主要活性物質(zhì)。

黑豆；田間霉菌；表兒茶素；抑菌活性；花色苷

黑豆為豆科植物大豆（Glycine max(L.)merr）的黑色種子。2015年版中國藥典記載：“黑豆性甘、平，歸脾腎經(jīng)，具有益精明目、養(yǎng)血祛風(fēng)，利水解毒之功效”[1]?！侗静菥V目》中記載：“黑豆入腎功多，故能治水、消脹、下氣、制風(fēng)熱而活血解毒”[2]。目前，關(guān)于黑豆的營養(yǎng)保健功能研究較多，其富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維素、花色苷、異黃酮、植物固醇等多種營養(yǎng)成分[3-4]，具有降低膽固醇、抗炎、抗氧化等多種功效[5]，使其成為典型的藥食同源食物。此外，黑豆中的活性蛋白[6]、多糖[7]、花青素等成分[8-9]亦具有良好的抑菌活性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，田間待收獲的大豆易受到黃曲霉菌、黑曲霉菌、串珠鐮刀菌和產(chǎn)黃青霉菌等田間霉菌的侵染而發(fā)生霉變[10]，而黑豆較其他顏色的大豆更能抵御田間霉菌的侵染[11]，但其抑菌活性成分尚不清楚。本研究以高抗田間霉變黑豆種質(zhì)的種皮為材料，以抑菌活性為指導(dǎo)，通過植物化學(xué)方法分離純化其抑菌活性成分，并鑒定其結(jié)構(gòu)，為開發(fā)防治大豆田間霉變的藥劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、循環(huán)水真空泵（河北省予華儀器有限公司）、真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺（新加坡易思高科技有限公司）、Bruker AVANCE 600核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）。Agilent 1260高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)，包括四元泵（G1311A）、在線真空脫氣機（G1322A）、柱溫箱（G1316A）、自動進樣器（G1313A）、Agilent 6120單四級桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 研究材料

正相層析柱硅膠（青島海洋化工廠分廠）、薄層硅膠層析板（默克化工技術(shù)（上海）有限公司）。分析純甲醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇（四川科龍化工試劑廠）、生物純二甲基亞砜（DMSO）。8種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品：飛燕草素半乳糖苷（DEA）、飛燕草素葡萄糖苷（DEL）、矢車菊素半乳糖苷（CYA）、矢車菊素葡萄糖苷（CYL）、天竺葵素葡萄糖苷（PEL）、矮牽牛色素葡萄糖苷（PET）、芍藥色素葡萄糖苷（PEO）、矢車菊素（CYC）均購自 PhytoLab GmbH&Co.KG，Germany。

試驗所用黑豆種質(zhì)為四川省南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的黑豆育種中間材料C103，經(jīng)鑒定，該材料為豆科蝶形花亞科大豆屬植物大豆（Glycine max(L.)merr），其籽粒較小，呈橢圓形，表皮黑色，光滑，子葉兩瓣，呈淡黃色。種質(zhì)資源現(xiàn)保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室。該黑豆種質(zhì)于2015年夏季種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研園區(qū)（四川雅安），采集的黑豆籽粒于室內(nèi)風(fēng)干后剝?nèi)》N皮，粉碎后密封保存于干燥器中備用。

供試霉菌為本實驗室從田間霉變的大豆籽粒上分離純化獲得的黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.nige）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）和產(chǎn)黃青霉菌（P.chrysogenum），菌種現(xiàn)保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室。

1.3 研究方法

1.3.2 黑豆種皮醇溶物的提取與萃取分層

黑豆種皮活性成分的分離、純化與鑒定參考張名位等的方法[12]，并做一定修改。取干燥的黑豆種皮粉末，按料液比1∶4加入甲醇于大燒瓶中浸提12 h，倒出濾液，加2倍體積甲醇80℃熱回流提取濾渣3 h，趁熱過濾，重復(fù)3次，合并所有濾液并抽濾，40℃下減壓濃縮濾液得總醇提物。超聲混懸總醇提物于水中，分別用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇逐步萃取，減壓濃縮、干燥得各萃取物。

1.3.2 提取物的抑菌活性評價

采用抑菌圈法對各提取物進行抑菌活性評價[13]。分別稱取適量黑豆種皮醇提物及各萃取物，以少量DMSO助溶后用無菌水配成50 mg/mL的溶液備用。將經(jīng)過活化的4種供試霉菌接種到馬丁培養(yǎng)基上，28℃下恒溫培養(yǎng)至分生孢子成熟，用無菌水洗脫孢子并配成2×106個/mL的菌懸液。取20 μL菌懸液于滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入20 mL冷卻至40℃左右的馬丁培養(yǎng)基，振蕩搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌的打孔器在每個培養(yǎng)皿中間部位打1個直徑為6 mm的小孔，加入種皮提取物溶液，以無菌水作對照，置28℃下恒溫培養(yǎng)2 d，測量抑菌圈的大小。每個樣品設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果計算平均值。

1.3.3 活性部位的進一步分離純化

根據(jù)抑菌活性結(jié)果，對活性最佳的乙酸乙酯萃取物作進一步分離純化。稱取適量乙酸乙酯萃取物，以正相硅膠（φ=75 μm）拌樣，干法上樣。根據(jù)薄層色譜法預(yù)試結(jié)果，選擇正己烷-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)（V∶V=3∶1、1∶1、1∶3）、氯仿-甲醇-水溶劑系統(tǒng)（V∶V∶V=3∶1∶0、1∶1∶0、10∶3∶1、7∶3∶1、6∶4∶1）依次梯度洗脫，將所得流分用薄層色譜檢測合并相似流分，得到E1～14共14個組分。將各組分用無菌水配成50、10、1、0.1mg/mL的梯度溶液，參照“1.3.2”的方法進行抑菌活性測定，結(jié)果表明，E13的抑菌活性最強，故先對其進行成分分析。稱取適量E13，甲醇溶解后過0.22 μm的有機相濾頭，濾液上高效液相色譜儀進行成分分析。色譜柱：YMC C18柱（250 mm×4.6mm）；流動相：30%甲醇水溶液；流速：0.8 mL/min；進樣量：15 μL；檢測波長：254 nm。分析結(jié)果顯示，E13呈現(xiàn)規(guī)則的單一色譜峰，表明該部位只含有一種物質(zhì)，可直接用于結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.4 抑菌單體化合物的結(jié)構(gòu)解析

將E13溶于氘代甲醇并轉(zhuǎn)移至2.5 mm×100 mm的核磁管中，以四甲基硅烷（TMS）為化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)，進行NMR譜分析，分別收集氫譜和碳譜數(shù)據(jù)。

1.3.5 黑豆種皮花色苷的定量分析

參考Wu H.等[14]的方法對黑豆種皮中的花色苷進行定量分析。準(zhǔn)確稱取黑豆種皮干燥粉末樣品100 mg于10 mL離心管中，加入2 mL甲醇酸性水溶液（VHCl∶VMeOH（80%）=1∶99）冰水浴上避光超聲提取3 h，4℃下13000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液過0.22 μm濾膜至2 mL進樣瓶中，上LC-MS檢測分析。色譜柱：X-Terra MSC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：10%甲酸水溶液（A）-甲醇/乙腈/水/甲酸的混合液（B，V∶V∶V∶V=22.5∶22.5∶40∶10）；梯度洗脫程序：0～8 min，83～80%A，8～10 min，80～65%A，10～20 min，65～52%A，20～25 min，52～83%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。質(zhì)譜干燥氣（N2）流速：12 L/min；霧化器壓力：45 Psig；干燥氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3800 V；離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離方式：正離子。SIM模式提取目標(biāo)化合物的色譜峰，目標(biāo)化合物的質(zhì)荷比（m/z）為 465（DEA）、465（DEL）、449（CYA）、449（CYL）、479（PET）、433（PEL）、463（PEO）和 287（CYC）。根據(jù) 8 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度與色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各花色苷的含量。試驗設(shè)置5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆種皮醇提物的抑菌活性比較

采用抑菌圈法比較了黑豆種皮甲醇粗提物及各萃取物對4種田間霉菌的抑菌效果。由表1可知，黑豆種皮醇提物能夠抑制4種霉菌的生長，黑豆種皮醇提物中存在抑制田間霉菌生長的活性物質(zhì)。比較各萃取物的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，正己烷萃取物和水萃取物的抑菌活性較差，與對照相比無顯著差異；乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物具有較強的抑菌活性，且乙酸乙酯萃取物對4種霉菌的抑制效果均顯著優(yōu)于正丁醇萃取物和甲醇粗提物；這表明黑豆種皮中的抑菌活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯萃取部位，而液相萃取對活性物質(zhì)具有明顯的富集作用。

表1 黑豆種皮醇提物及各萃取層對4種田間霉菌的抑菌效果Table1 The antimycotic activities of ethanol extract and each fraction from black soybean seed coat to field mold mm

2.2 抑菌活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定

通過對乙酸乙酯萃取物活性部位E13進行成分分析，在30 min檢測時間內(nèi)只出現(xiàn)1個色譜峰，且峰形較好，左右對稱，無拖尾現(xiàn)象（見圖1）。該結(jié)果表明，E13只含有一種化合物。E13干燥樣品為白色結(jié)晶粉末，溶于甲醇。以CD3OD為溶劑對E13進行1維NMR分析，其1H和13C波譜數(shù)據(jù)分別為：1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.99（1H，d，J=2.0 Hz，H-2’），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’），6.77（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6’），5.96（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），5.93（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），4.83（1H，brs，H-2），4.20（1H，m，H-3），2.86（1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-4），2.74（1H，dd，J=17.0，3.0 Hz，H-4），5.93（1H，d，J=2.0 Hz，H-8）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：157.98（C-5），157.86（C-7），157.36（C-9），145.93（C-3’），145.77（C-4’），132.28（C-1’），119.41（C-6’），115.90（C-2’），115.33（C-5’），100.09（C-10），96.42（C-6），95.90（C-8），79.87（C-2），67.48（C-3），29.24（C-4）。結(jié)合相關(guān)文獻比對[15-16]，上述波譜數(shù)據(jù)與表兒茶素（（2R，3R）-2-(3，4-Dihydroxyphenyl)chroman-3，5，7-triol，Epicatechin）完全一致，確定該化合物為表兒茶素（見圖1）。

圖1 E13 HPLC圖及表兒茶素化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure1 The chromatogram of fraction E13 and structure of epicatechin

2.3 表兒茶素的抑菌活性鑒定

表兒茶素對4種供試田間霉菌抑菌效果見表2。從表中可看出，0.1 mg/mL和1 mg/mL的表兒茶素對4種霉菌無明顯的抑菌效果，當(dāng)濃度大于10 mg/mL時開始具有明顯的抑菌效果。抑菌能力表現(xiàn)為：黃曲霉菌＞產(chǎn)黃青霉菌＞黑曲霉菌＞串珠鐮刀菌，與乙酸乙酯萃取物對4種霉菌的抑菌能力排序一致。

2.4 黑豆種皮花色苷含量分析

LC-MS分析結(jié)果表明，從黑豆種皮中檢測到了5種花色苷成分 CYL、PEO、CYA、PEL 和 CYC，未檢測到DEA、DEL和PET（見圖2）。5種花色苷的總含量為62.15 mg/g，其中以CYL的含量最高，占總花色苷含量的97.10%，其次為PEO（2.14%），CYC的含量最低（0.04%）（見表 3）。

表2 表兒茶素對4種田間霉菌的抑菌效果Table2 The antimycotic activities of epicatechin to field mold mm

表3 黑豆種皮中5種花色苷含量Table3 The concentration of five anthocyanins in black soybean seed coat

3 討論與結(jié)論

植物源抑菌活性成分源自天然，易降解，具有低毒、低殘留、對人畜相對安全等優(yōu)點，成為當(dāng)今研發(fā)新型殺菌抑菌劑的熱點[17]。植物源活性成分的常規(guī)制備方法主要是根據(jù)各成分的物理化學(xué)特性，采用萃取法、離子交換法和柱層析等方法進行分離純化[18]。但植物中的組分復(fù)雜多樣，有效成分含量較低，采用常規(guī)方法制備周期長、工序多、盲目性大、分離效率低。本研究在對黑豆種皮抑菌活性成分的分離純化過程中，以抑菌活性為指導(dǎo)，逐步追蹤活性部位，使分離純化過程更有針對性，減少了盲目分離成分所浪費的人力和物力，提高了活性成分的純化效率。

圖2 花色苷標(biāo)準(zhǔn)品及樣品提取離子流圖Figure2 Ion chromatograms of anthocyanin standard mixture and seed coat extract

黑豆種皮因含有大量花色苷等黃酮類成分而具有良好的生物活性。張花利等[9]研究表明，黑豆種皮中的黃酮類提取物能夠抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長。褚盼盼等[8]的研究則進一步指出，黑豆種皮中的花青素對這3種細(xì)菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性。而關(guān)于黑豆種皮對真菌的抑制效果目前還少見報道。本研究結(jié)果顯示，黑豆種皮甲醇提取物能有效地抑制4種田間霉菌的生長，表明黑豆種皮中存在抑制真菌的活性成分。通過比較各萃取物的抑菌活性，將乙酸乙酯萃取物確定為重點分析部位，通過抑菌活性追蹤，最終分離純化得到抑制田間霉菌的活性成分表兒茶素。

表兒茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，屬于類黃酮化合物中的黃烷-3-醇類，與花色苷、原花青素等共享從苯丙氨酸到花青素這一部分生物合成途徑?；ㄇ嗨卦诨ㄇ嗨剡€原酶的作用下生成兒茶素和表兒茶素，可進一步聚合成原花青素，而糖基轉(zhuǎn)移酶則競爭性地催化花青素形成花色苷[19]。已有研究表明，黑豆種皮化學(xué)成分以多酚類為主，包括原花青素、花色苷及兒茶素三大類。其中，花色苷的主要成分為矢車菊素葡萄糖苷（CYL），占總花色苷的比例高達90%以上[14]，而表兒茶素的含量則相對較低（0.1%～0.4%）[20]。本研究中，我們從黑豆種皮中分離純化得到大量的表兒茶素，其可能為種皮在提取過程中的高溫處理導(dǎo)致原花青素和花色苷降解所致。

本研究對黑豆種皮中抑菌活性成分進行了跟蹤純化，表兒茶素作為主要活性成分被大量純化獲得，一方面，該純化過程效率較高；另一方面，卻忽略了微量活性化合物的富集純化。為深入探究大豆抗田間霉變機理，篩選高抑菌活性成分，還需對種皮中的其他成分開展更全面的研究。

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Purification and Identification of Anti-Field Moldy Compounds in Black Soybean Seed Coat

DENG Jun-cai1，YANG Cai-qiong1，2，WU Hai-jun1，2，YANG Wen-yu1，LIU Jiang1，2*
（1.Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in Southwest，Ministry of Agriculture，Chengdu 611130，China；2.Institute of Ecological Agriculture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

【Objective】To investigate the chemical constitutes in black soybean seed coat with antifungal activity to field fungi.【Method】The antifungal constitutes were isolated and purified by stratification and silica gel column chromatography guided by antifungal activities.The structures of antimycotic compounds were elucidated on the basis of various spectroscopic analysis and NMR data comparisons.The antifungal activity were tested by inhibition circle method.【Results】The antimycotic compounds in black soybean seed coat were mainly concentrated in ethyl acetate extraction，from which epicatechin was isolated.The result indicated that epicatechin possessed significantly antifungal activity to Aspergillus flavus，Aspergillus nige，F(xiàn)usarium moniliforme and Penicillium chrysogenum.The results of quantitative analysis showed black soybean seed coat contained large amount of cyanidin 3-glucoside and other forms of anthocyanins，which could be converted to epicatechin during extraction process.【Conclusion】Epicatechin is one of the basic ingredients constituting polyphenol compounds in black soybean seed coat,and possesses antifungal activity to field fungi.

black soybean；field moldy；epicatechin；antimycotic activity；anthocyanin

R284.1；R284.2

A

1000-2650（2017）04-0499-05

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.006

2017-05-22

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31401329）；中國博士后科學(xué)基金面上項目（2014M560724）資助。

鄧俊才，博士研究生。*責(zé)任作者：劉江，博士，副教授，從事植物化學(xué)生態(tài)學(xué)研究，E-mail：jiangliu@sicau.edu.cn。

（本文審稿：武 晶；責(zé)任編輯：劉詩航；英文編輯：劉詩航）