李世安，劉友，劉希光，李愛民

神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

李世安，劉友，劉希光，李愛民

目的通過生物信息學(xué)技術(shù)探討神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元間基因表達(dá)的差異，找出關(guān)鍵的差異基因及其潛在的分子調(diào)控機(jī)制；并對(duì)其所涉及的功能進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。方法從GEO表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元相關(guān)的表達(dá)譜基因芯片數(shù)據(jù)系列GSE70171，導(dǎo)入基因芯片在線分析工具morpheus，篩選出神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元之間表達(dá)差異的基因，并構(gòu)建聚類分析熱圖。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析，并使用STRING分析與Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果篩選出表達(dá)差異的基因有4 022個(gè)，其中神經(jīng)干細(xì)胞比神經(jīng)元上調(diào)的基因有2 146個(gè)，下調(diào)基因1 876個(gè)。對(duì)表達(dá)差異的基因進(jìn)行的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的基因主要與神經(jīng)元功能相關(guān)，上調(diào)基因與神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞再生和有腫瘤特征相關(guān)，其中神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期通路和癌癥通路存在研究?jī)r(jià)值。結(jié)論神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在表達(dá)差異基因。幾個(gè)關(guān)鍵基因CDC6、CDKN2A、CDC14A、BUB1、TTK、CHEK1、CDC25C在細(xì)胞周期通路中可能與神經(jīng)干細(xì)胞再生功能相關(guān)。而KIF23、CDKN2A、TNC、CDC25C、CDCA5、BRCA1可能與神經(jīng)干細(xì)胞的腫瘤特征相關(guān)。然而，這些關(guān)鍵基因的功能還需要今后的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

神經(jīng)干細(xì)胞；生物信息學(xué)；基因；腫瘤

在1992年，Reynolds和Weiss等[1]在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中發(fā)現(xiàn)自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)。這些細(xì)胞能增殖、遷移和分化成腦和脊髓所有細(xì)胞類型，包括神經(jīng)元[2-4]。即神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)具有在特定條件下自我更新，并分化成神經(jīng)譜系(神經(jīng)元)的能力。當(dāng)發(fā)生神經(jīng)損傷等病理改變后，處于休眠狀態(tài)的NSCs進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，然后發(fā)生激活，增殖并遷移至受損部位，誘導(dǎo)或再重塑成新的神經(jīng)細(xì)胞[5]。這些新的細(xì)胞可以代替受損的細(xì)胞，參與形成新的神經(jīng)網(wǎng)路，并促進(jìn)腦損傷的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)[6]。但是，NSCs分化的基礎(chǔ)機(jī)制仍然不完全清楚，尚需要進(jìn)一步詳細(xì)的研究。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)，探討神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元之間基因表達(dá)的差異，找出關(guān)鍵的差異基因及其潛在的分子調(diào)控機(jī)制，并分析預(yù)測(cè)其所涉及的功能；為神經(jīng)干細(xì)胞及其分化的細(xì)胞可能產(chǎn)生有價(jià)值和穩(wěn)定的人類神經(jīng)細(xì)胞亞型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究的數(shù)據(jù)來源于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene xpression Omnibus,GEO)；使用以下檢索：“Neural Stem Cells”(關(guān)鍵詞)，“Mus musculus”(生物)，“陣列表達(dá)分析”(研究型)和“組織”(屬性名稱)。系統(tǒng)評(píng)估后，檢索了976項(xiàng)GSE研究。研究納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)診斷為神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的樣本；(2)每組樣本數(shù)均超過2例；(3)mRNA基因表達(dá)譜；(4)足夠基因探針信息進(jìn)行分析；(5)并不是誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞且沒有其他處理因素影響的細(xì)胞。然后，收集到基因表達(dá)譜系列號(hào)為GSE70171進(jìn)行分析。最終6例樣本數(shù)據(jù)(GSM1717919、GSM1717920、GSM1717921 為神經(jīng)元組織，GSM1717922、GSM1717923、GSM1717924為神經(jīng)干細(xì)胞組織)被納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用了美國(guó)Affymetrix公司表達(dá)譜芯片(神經(jīng)元與神經(jīng)干細(xì)胞樣本數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理)。

1.2 方法 將6例樣本數(shù)據(jù)導(dǎo)入基因芯片在線分析工具morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)，隨后對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元間差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。根據(jù)基因名稱和基因芯片信號(hào)灰度值過濾基因表達(dá)缺失數(shù)據(jù)(<5%),然后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的基因信號(hào)值進(jìn)行fold change檢驗(yàn)(log2FC<-2或log2FC>2，P<0.05，q<0.05)，即以差異倍數(shù)為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，取對(duì)數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，用2倍差異得到明顯差異表達(dá)基因，同時(shí)以P值和q值統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選。最后通過信噪比(scalable profile,SNP)的差異進(jìn)行排序，用pearson相關(guān)分析生成聚類分析熱圖。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析(用于注釋基因潛在生物現(xiàn)象的常見方法，包含基因產(chǎn)物和基因序列的注釋[7-8])，從分子功能、生物過程和細(xì)胞組成的角度對(duì)其富集分析(通過P值統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選和霍赫貝格校正多重檢測(cè)篩選后以相關(guān)基因數(shù)排序)。同時(shí)進(jìn)行KEGG分析(用生物學(xué)方法解讀基因組序列和其他高通量數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)資源[9])，從信號(hào)通路角度對(duì)其富集分析。

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interactions,PPI)的分析(蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵評(píng)估和整合，包括直接和間接作用[10])。分析PPI網(wǎng)絡(luò)圖，找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的蛋白質(zhì)和相關(guān)的蛋白及其相應(yīng)的關(guān)系與穩(wěn)定性。

利用Cytoscape軟件(一種流行的開源軟件工具，用于視覺探索由蛋白質(zhì)、基因和其他類型的相互作用組成的生物分子之間相互作用網(wǎng)絡(luò)[11])進(jìn)行基因數(shù)據(jù)的整合及差異基因上下調(diào)節(jié)映射的可視化。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因篩選及其熱圖 通過基因芯片在線分析工具morpheus分析，獲得出現(xiàn)明顯表達(dá)差異的基因共4 022個(gè)；其中神經(jīng)干細(xì)胞比神經(jīng)元上調(diào)的基因有2 146個(gè)，下調(diào)基因1 876個(gè)。通過pearson相關(guān)分析生成聚類熱圖，由于定量資料數(shù)據(jù)通過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后服從正態(tài)分布，進(jìn)行分層聚類；聚類距離用pearson計(jì)算的相關(guān)系數(shù)矩陣，取平均值。見圖1。

圖1 mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)系列集GSE70171中表達(dá)差異的基因鑒定及pearson相關(guān)聚類熱圖(紅：上調(diào)差異基因；藍(lán)：下調(diào)差異基因)

2.2 差異基因GO分析及KEGG分析結(jié)果 表達(dá)上調(diào)基因GO分析結(jié)果顯示涉及：生物過程1 591條，細(xì)胞組成131條，分子功能245條。表達(dá)下調(diào)基因GO分析結(jié)果顯示涉及：生物過程1 469條，細(xì)胞組成192條，分子功能248條。見圖2。

2.3 差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析的結(jié)果 表達(dá)上調(diào)基因KEGG分析結(jié)果顯示涉及53條；表達(dá)下調(diào)的基因KEGG分析結(jié)果顯示涉及75條。根據(jù)KEGG結(jié)果分析NSCs與神經(jīng)元在代謝通路上的主要差異，見圖3、圖4。在NSCs與神經(jīng)元差異基因中提取與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，見表1。然后單獨(dú)分析NSCs與神經(jīng)元差異基因在癌癥的途徑通路上變化，見圖5。

A：上調(diào)差異基因 B:下調(diào)差異基因圖2 差異基因相關(guān)GO分析結(jié)果(前5位條，縱坐標(biāo)：相關(guān)基因數(shù))

圖3 上調(diào)差異基因與下調(diào)差異基因KEGG分析結(jié)果對(duì)比(前12位條)

圖4 神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元在代謝通路中基因序列富集和缺失對(duì)比(前6位條)

表1 差異基因與腫瘤相關(guān)通路KEGG分析結(jié)果

(續(xù)表)

圖5 差異基因涉及的癌癥通路(★：差異基因)

2.4 差異表達(dá)基因的STRING分析結(jié)果 通過STRING在線工具對(duì)差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，其中顯示節(jié)點(diǎn)數(shù)101個(gè)(差異基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)及其相關(guān)蛋白質(zhì))，邊數(shù)830個(gè)(差異基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)及其相關(guān)蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系的標(biāo)識(shí))。圖中顯示有3大塊PPI網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，即核心蛋白質(zhì)，若刪除這些節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低。見圖6。

2.5 差異表達(dá)基因進(jìn)行的Cytoscape分析結(jié)果 利用Cytoscape軟件根據(jù)log2FC對(duì)差異基因上下調(diào)進(jìn)行注釋并且去除離散的差異基因。其中紅色代表神經(jīng)干細(xì)胞比神經(jīng)元上調(diào)的基因，即NSCs表達(dá)量多的基因；藍(lán)色代表神經(jīng)干細(xì)胞比神經(jīng)元下調(diào)的基因，即神經(jīng)元表達(dá)量多的基因。通過結(jié)合KEGG分析結(jié)果，對(duì)在癌癥中通路單獨(dú)注釋。其中差異基因在癌癥中通路上對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)及其相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系以基因與基因間的連接線來表示。見圖7。

圖6 差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因

圖7 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)中KEGG在癌癥的途徑通路注釋(紅：上調(diào)；藍(lán)：下調(diào))

3 討 論

研究表明神經(jīng)干細(xì)胞在不同微環(huán)境中接收細(xì)胞周圍的特異性分子信號(hào)后分化為不同類型的神經(jīng)元[12]。這些新形成的神經(jīng)元建立了新的神經(jīng)回路或修改現(xiàn)有途徑。在這種狀況下，若大腦中的神經(jīng)元發(fā)生死亡等病理改變，NSCs治療似乎是一種有希望恢復(fù)失去的神經(jīng)功能的方法。神經(jīng)干細(xì)胞分化為特定類型的神經(jīng)元及其形成的連接網(wǎng)絡(luò)可以修復(fù)和替代已死亡或受損的神經(jīng)元[13]。

在本研究中，篩選出正常的神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元之間表達(dá)有差異的基因共4 022個(gè)，包括 2 146個(gè)上調(diào)基因和1 876個(gè)下調(diào)基因。GO分析結(jié)果顯示，下調(diào)富集的基因主要參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元的生長(zhǎng)、神經(jīng)元分化；上調(diào)富集的基因主要參與細(xì)胞表達(dá)、細(xì)胞大分子生物合成、調(diào)節(jié)氮化合物代謝、調(diào)節(jié)含核苷酸堿基化合物的代謝過程。KEGG分析結(jié)果顯示，下調(diào)的基因主要分布在癌癥通路、神經(jīng)配體受體相互作用、鈣信號(hào)通路、谷氨酸能突觸等上；上調(diào)富集的基因主要分布代謝通路、細(xì)胞周期、癌癥通路、癌癥微小RNA等中。結(jié)合功能和通路注釋，上調(diào)基因主要展現(xiàn)了神經(jīng)元的具體功能；在細(xì)胞周期通路上，上調(diào)的基因有CDC6、CDKN2A、CDC14A、BUB1、TTK、CHEK1、CDC25C，這表明上調(diào)的基因主要展現(xiàn)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分裂和自我更新的功能。最后，差異基因通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)在上調(diào)的基因中核心的蛋白質(zhì)相互作用穩(wěn)定，并且細(xì)胞周期通路中蛋白集中。以上分析結(jié)果顯示了NSCs的再生潛能和CNS中的神經(jīng)細(xì)胞的可塑性，并且進(jìn)一步驗(yàn)證了利用NSCs再生修復(fù)功能，可以幫助損傷后腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)；如出血性卒中[14]和創(chuàng)傷性腦損傷[15]等疾病。

然而，在腫瘤相關(guān)通路上，上、下調(diào)的基因都包括腫瘤相關(guān)的通路，而上調(diào)的基因更多；如癌癥中的途徑、HTLV-I感染、癌癥中的微小RNA、病毒致癌等。單獨(dú)提取得分最高癌癥通路進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，利用Cytoscape軟件構(gòu)成差異圖顯示基因表達(dá)量與之相關(guān)基因的富集。找出其中幾個(gè)富集得分高的基因(KIF23、CDKN2A、TNC、CDC25C、 CDCA5、 BRCA1)來，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中做GeneRIFs注釋。在大多數(shù)人類惡性腫瘤中觀察到驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員23(KIF23)的高表達(dá)；驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員23是微管依賴性分子馬達(dá)的成員，負(fù)責(zé)在細(xì)胞有絲分裂期間細(xì)胞器的運(yùn)輸與染色體的移動(dòng)。KIF23是一種核蛋白質(zhì)，其定位于有絲分裂軸的區(qū)域之間，在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平高于正常腦組織[16]。有研究表明與色素痣組織相比，黑素瘤組織中CDKN2A(p16INK4A)和CDKN2A(p14ARF)mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低；CDKN2A(p16INK4A)和CDKN2A(p14ARF)過表達(dá)抑制A375細(xì)胞從G0/ G1到S期的增殖、遷移、侵襲和進(jìn)展，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。大量實(shí)驗(yàn)證明TNC(粘附調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)分子)在許多人類惡性腫瘤中高度表達(dá)。癌細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的粘附調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)分子TNC的過表達(dá)是食管鱗狀細(xì)胞癌患者整體存活和無(wú)病生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。CDC25C(細(xì)胞分裂周期25同源C)是細(xì)胞周期G2期向M期發(fā)生轉(zhuǎn)移必不可少的。研究顯示，在細(xì)胞間期中CDC25C抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)，并介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAP)家族的細(xì)胞凋亡[19]。這些研究結(jié)果提示神經(jīng)干細(xì)胞有發(fā)生腫瘤的可能。

本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)分析，利用morpheus分析工具、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)、STRING分析和Cytoscape軟件，篩選出神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元差異的表達(dá)基因，從生物學(xué)功能與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)等方面進(jìn)行深入研究，探討表達(dá)的差異基因可能的分子機(jī)制，為研究神經(jīng)干細(xì)胞的臨床治療等方面提供幫助。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在明顯表達(dá)差異基因。幾個(gè)關(guān)鍵基因CDC6、CDKN2A、CDC14A、BUB1、TTK、CHEK1、CDC25C在細(xì)胞周期通路中可能與神經(jīng)干細(xì)胞再生功能相關(guān)；而KIF23、CDKN2A、TNC、CDC25C、CDCA5、BRCA1可能與神經(jīng)干細(xì)胞的腫瘤性相關(guān)。但是這些關(guān)鍵基因的確切功能還需要今后的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

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Bioinformaticsanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinneuralstemcellsandneurons

LIShi-an,LIUYou,LIUXi-guang,etal.

DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedLianyungangHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Lianyungang222002,China.

Correspondingauther:LIUYou

ObjectiveThrough the bioinformatic technique,the differences in gene expression between neural stem cells and neurons were explored.The key genes and their potential molecular regulation mechanisms were identified.The functions involved were analyzed and predicted.MethodsThe gene series GSE70171 related to neural stem cells and neurons were downloaded from the GEO expression profile database.Firstly,the genes were analyzed by gene chip online analysis tool Morpheus.Then among these genes,genes that differ in expression between neural stem cells and neurons were screened out.Finally,expression differences in gene construction cluster analysis heat map.DAVID database was used to perform GO functional analysis and KEGG pathway enrichment analysis.The STRING analysis and Cytoscape software were used to build PPI network.ResultsThere were 4022 genes screened out,among which neurons had more 2 146 genes down-regulated and 1 846 genes up-regulated than neural stem cells.The bioinformatic analysis of the genes expressing the differences revealed that the down-regulated genes were mainly related to neuronal function,and the up-regulation genes were related to the regeneration of neural stem cells and the neoplasms characteristics.The cell cycle pathway and the microRNAs pathway of neural stem cells were of great value.ConclusionsThe result is a differential gene between neural stem cells and neurons.Several key genes,such as CDC6,CDKN2A,CDC14A,BUB1,TTK,CHEK1,CDC25C,may be related to the regeneration function of neural stem cells in the cell cycle pathway.And KIF23,CDKN2A,TNC,CDC25C,CDCA5,BRCA1 may be related to the neoplasms characteristics of neural stem cells.However,the function of these key genes requires further confirmation in future experimental studies.

neural stem cell;bioinformatics;gene;neoplasm

222002 連云港，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院神經(jīng)外科

劉友

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.06.002

R741.05

A

1672-7770(2017)06-0406-08

(收稿2017-05-17 修回2017-07-31)