魏曉雨，姜國棟，陳泓，王美慧，徐杰，邊雨，姜文月#（.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，長春 300；.修正藥業(yè)集團股份有限公司，吉林通化 34000）

貞芪扶正顆粒的HPLC指紋圖譜研究Δ

魏曉雨1＊，姜國棟2，陳泓2，王美慧1，徐杰1，邊雨1，姜文月1#（1.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，長春 130012；2.修正藥業(yè)集團股份有限公司，吉林通化 134000）

目的：建立貞芪扶正顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLCELSD）。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測器蒸發(fā)光溫度為50℃，進樣量為10 μL。以特女貞苷為參照，測定7批貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A）版進行共有峰指認和相似度評價。結(jié)果：7批貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜有13個共有峰。經(jīng)驗證，7批樣品HPLC圖譜中有3批樣品相似度＞0.9，與對照指紋圖譜具有較好一致性；4批樣品相似度＜0.9，與對照指紋圖譜一致性較差。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為貞芪扶正顆粒的質(zhì)量評價提供參考。

貞芪扶正顆粒；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法；指紋圖譜；質(zhì)量標準

貞芪扶正顆粒由女貞子和黃芪兩味藥材組成[1]，收載于《衛(wèi)生部頒藥品標準·中藥成方制劑》（第20冊），具有提高人體免疫力，保護骨髓及腎上腺皮質(zhì)的功能[2-3]。大量藥學(xué)研究和臨床應(yīng)用已證實其可以作為癌癥治療的輔助藥物[4-6]。目前全國注冊在案的貞芪扶正顆粒生產(chǎn)企業(yè)共有11家，分為無糖型及有糖型兩種，現(xiàn)行質(zhì)量標準只對組方中黃芪藥材所含的黃芪甲苷進行定性及定量分析[7]，而未對女貞子藥材有任何限定。中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性為其質(zhì)量控制增加了難度，只對單一成分或特征性成分研究不能全面控制其質(zhì)量穩(wěn)定性[8-11]，而指紋圖譜技術(shù)能夠全面呈現(xiàn)樣品的復(fù)雜性，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評價體系中[12-13]。鑒于此，筆者采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）建立了貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜[14]，運用相似度評價方法對7批貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜進行了分析評價，并進行特征峰指認，以期為完善該制劑的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

RIGOL L-3000型HPLC儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、蒸發(fā)光檢測器（北京普源精電科技有限公司）；ME204E型雙量程電子分析天平（瑞士Mettl-er-Toledo公司）；SB-5200D型超聲波清洗機（寧夏新芝生物科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

貞芪扶正顆粒（A廠，批號：S1，無糖型，規(guī)格：5g/袋；B 廠，批號：S2，無糖型，規(guī)格：5 g/袋；C廠，批號：S3，無糖型，規(guī)格：5 g/袋；D 廠，批號：S4，有糖型，規(guī)格：15 g/袋；E 廠，批號：S5，有糖型，規(guī)格：15 g/袋；F 廠，批號：S6，無糖型，規(guī)格：5 g/袋；G廠，批號：S7，有糖型，規(guī)格：15 g/袋）；芒柄花素對照品（批號：111703-200501，純度：98.8%）、紅景天苷對照品（批號：110818-201206，純度：93.4%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：111920-201505，純度：97.6%）、特女貞苷對照品（批號：111926-201404，純度：93.3%）、黃芪甲苷對照品（批號：110781-201515，純度：97.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

試驗用藥材均購自某藥店，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院張連學(xué)教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，95%→90%A；10～30 min，90%→78%A；30～40 min，78%→73%A；40～65 min，73%→48%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測器蒸發(fā)光溫度：50℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取芒柄花素對照品5.23 mg、紅景天苷對照品4.45 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品4.67 mg、特女貞苷對照品5.34 mg、黃芪甲苷對照品5.64 mg，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含芒柄花素0.523 mg、紅景天苷0.445 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.467 mg、特女貞苷0.534 mg、黃芪甲苷0.564 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取有糖型樣品15 g（無糖型樣品5 g），精密稱定，精密加入甲醇50 mL，超聲（功率：220 W，頻率：33 kHz，下同）處理15 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，通過D101大孔樹脂（柱高：12 cm，內(nèi)徑：1.5 cm），以3倍柱體積的水進行洗脫，棄去水液；再分別用3倍柱體積的30%乙醇溶液、60%乙醇溶液、95%乙醇溶液依次洗脫，收集上述洗脫液，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 單味藥材溶液 精密稱取“1.3”項下黃芪藥材粉末及女貞子藥材粉末（過3號篩）各約1 g，按“2.2.2”項下方法制得單味藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以特女貞苷的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，13個共有峰相對保留時間的RSD＜0.5%（n＝6），相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以特女貞苷的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，13個共有峰相對保留時間的RSD＜0.5%（n＝10），相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝10），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（批號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以特女貞苷的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，13個共有峰相對保留時間的RSD＜0.5%（n＝6），相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成、共有峰的歸屬和指認及相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取7批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對7批樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 7批樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 7 batches of samples and control fingerprints

2.4.2 共有峰的歸屬和指認 比較圖2中各色譜（其中5號為參照峰）并對HPLC圖譜共有峰進行歸屬和指認。結(jié)果顯示，樣品HPLC圖譜13個共有峰中1、2、4、5、6、7號峰來源于女貞子，3、8、9、10、11、12、13號來源于黃芪。共有峰中1、3、5、9、10號色譜峰分別指認為紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷、芒柄花素、黃芪甲苷，經(jīng)統(tǒng)計上述5個色譜峰面積之和約占共有峰總面積的60%。

2.4.3 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對7批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結(jié)果，7批樣品HPLC圖譜中有3批樣品相似度＞0.9，4批樣品相似度＜0.9，詳見表1；各共有峰的相對保留峰面積和相對保留時間見表2和表3。

表1 7批樣品相似度評價結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 7 batches of samples

表2 7批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks in HPLC fingerprints of 7 batches of samples

表3 7批樣品HPLC共有峰的相對保留時間Tab 3 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of 7 batches of samples

3 討論

3.1 提取方式及提取溶劑的確定

本研究比較了加熱回流與超聲兩種提取方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者沒有明顯差異，但超聲提取法操作更簡單、快捷且溶劑損耗少，故選取超聲提取法作為本研究的提取方法。本研究也比較了不同提取溶劑（80%甲醇溶液、甲醇）的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑時，雜質(zhì)較少且澄清，色譜峰形好、基線平穩(wěn)，故選取甲醇為提取溶劑。

3.2 色譜柱和流動相的選擇

本研究對比了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）與ACE5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離效果較好，因此選擇上述色譜柱進行試驗。還比較了甲醇-水、乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫時的色譜分離情況，結(jié)果以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，所得色譜分離度較好，基線平穩(wěn)，有利于各色譜峰的分析。因此，本試驗選擇乙腈-水為流動相。

3.3 不同廠家貞芪扶正顆?；谙嗨贫鹊馁|(zhì)量差異分析

本試驗首次建立了貞芪扶正顆粒HPLC的指紋圖譜，標定了13個共有峰，為有效控制貞芪扶正顆粒成品的質(zhì)量提供了理論依據(jù)。本試驗采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A）對所得的HPLC指紋圖譜進行相似度分析，并與所生成的對照圖譜進行比較，結(jié)果7批樣品HPLC指紋圖譜中有3批樣品相似度＞0.9，與對照指紋圖譜具有較好一致性；4批樣品相似度＜0.9，與對照指紋圖譜一致性較差。說明不同廠家樣品在成分的比例上有所差異，而造成這種差異可能與成品原料質(zhì)量有關(guān)。黃芪及女貞子屬于廣泛種植藥材，地域等的不同可能造成藥材成品間含量差異較大；其次，各廠家生產(chǎn)工藝也不盡相同，最終導(dǎo)致各廠家成分質(zhì)量差異較大。因此，對中藥制劑進行標準化研究是控制中藥制劑質(zhì)量穩(wěn)定的重要措施，從藥材源頭進行控制，對生產(chǎn)工藝進行標準化規(guī)定，才能有效降低不同廠家同品種間療效的差異。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為貞芪扶正顆粒的鑒別質(zhì)量評價提供參考。

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Study on HPLC Fingerprint of Zhenqi Fuzheng Granules

WEI Xiaoyu1，JIANG Guodong2，CHEN Hong2，WANG Meihui1，XU Jie1，BIAN Yu1，JIANG Wenyue1（1.Jilin Modern TCM Engineering and Research Center Co.，Ltd.，Changchun 130012，China；2.Xiuzheng Pharmaceutical Group Co.，Ltd，Jilin Tonghua 134000，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Zhenqi fuzheng granules.METHODS：HPLC-ELSD method was adopted.The determination was performed on Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min with column temperature of 40 ℃.The detector evaporation temperature was 50 ℃，and sample size was 10 μL.Using specnuezhenide as reference，HPLC chromatograms of 7 batches of Zhenqi fuzheng granules were determined.The identification and similarity evaluation of common peaks were conducted by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：There were 13 common peaks in HPLC chromatograms of 7 batches of samples.After validated，the similarity of 3 batches of samples in HPLC chromatograms of 7 batches of samples were higher than 0.9，which were in good agreement with control fingerprints.The similarity of 4 batches of samples were＜0.9，which were poorly same to control fingerprint.CONCLUSIONS：Established fingerprint can provide reference for quality evaluation of Zhenqi fuzheng granules.

Zhenqi fuzheng granules；HPLC-ELSD；Fingerprint；Quality standard

R927

A

1001-0408（2017）33-4691-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.23

國家中藥標準化項目（No.ZYBZH-C-JL-26）；吉林省醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項引導(dǎo)資金項目（No.YYZX201503）

＊助理工程師，碩士。研究方向：中藥二次開發(fā)。E-mail：weixiaoyu1547@163.com

#通信作者：工程師，博士。研究方向：新藥及保健食品開發(fā)。電話：0431-89255017。E-mail：542030923@qq.com

（編輯：劉 柳）

2017-06-16

2017-09-15）