陳美君，李峰慶，陳鴻平，劉珈羽，劉友平

中藥白及與黃花白及的UPLC指紋圖譜研究

陳美君，李峰慶，陳鴻平，劉珈羽，劉友平

目的：建立中藥白及與黃花白及的UPLC特征指紋圖譜，同時對二者的特征指紋圖譜進行比較，為二者的質(zhì)量等同性評價提供參考。方法：采用Agilent ZORBAX EP C18(3.0×100mm，1.8μm) 色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水為流動相，梯度洗脫，流速0.6mL·min-1，檢測波長280nm，柱溫30℃，進樣量1μL。分別建立了白及與黃花白及的UPLC指紋圖譜方法并評價了多批次的相似度，二者均得到15個相同的共有峰。同時將14批白及、14批黃花白及以及3批小白及合并在一起進行相似度評價。結(jié)果：除2批（S7、S11）白及樣品相似度較低外，其余29批樣品之間的相似度均高達0.85，提示白及與黃花白及、小白及相似度較高。聚類分析及主成分分析結(jié)果與相似度評價相一致。結(jié)論：該方法可用于白及藥材質(zhì)量評價。從指紋圖譜結(jié)果來看，白及、黃花白及、小白及所含化學(xué)成分類似，可為三者質(zhì)量等同性評價做一參考。

白及；黃花白及；特征指紋圖譜；UPLC；質(zhì)量等同性

白及為蘭科植物白及（Bletilla striata(Thunb.)Reiehb.f.）的干燥塊莖。白及始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，在我國藥用歷史悠久，療效顯著[1]。主產(chǎn)于貴州、四川、云南、安徽、浙江、甘肅及長江以南地區(qū)。近年來隨著白及的應(yīng)用范圍不斷擴大，用量不斷增加，而白及資源遭自然及人為因素破壞，野生白及資源瀕臨枯竭，造成市面上供不應(yīng)求，受白及植株繁殖困難影響，人工栽培白及還未能改善這一現(xiàn)狀，導(dǎo)致白及價格居高不下。白及屬在我國共有4個種，其他種如黃花白及（Bletilla ochracea Schltr.）、小白及（Bletilla formosana(Hayata) Schltr.）、華白及（Bletilla sinensis (Rolfe)Schltr.）等均收錄于各地藥材標(biāo)準(zhǔn)中作為藥材入藥，因與白及的外觀形狀差異很小，目前市場上也有許多將這三種混入或者直接當(dāng)作白及出售，目前對四者化學(xué)成分、品質(zhì)評價方面的研究還處于較初級階段。本課題組擬采用UPLC建立白及以及黃花白及、小白及藥材的特征指紋圖譜，較全面的研究白及與黃花白及所含化學(xué)成分種類及含量的相似度，為三者藥材品質(zhì)評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290型UPLC(DAD檢測器，Agilent OpenLAB工作站，安捷倫科技有限公司)；DSY-2-4孔恒溫水浴鍋（北京市國華醫(yī)療器械廠）；BP211D型電子分析天平(十萬分之一) (德國Sartorius公司)；BP121S型(萬分之一) (德國Sartorius公司)。

1.2 試劑

對照品雙[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（militarine）（批號15122224）為中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純(Sigama 公司) ，磷酸、甲醇為分析純，水為自制超純水；樣品部分收集于藥材市場，部分為課題組采集，經(jīng)ITS2進行DNA條形碼鑒別，共確認(rèn)18批白及樣品，18批黃花白及樣品及3批小白及樣品，樣品具體信息見下表1。

表1 樣品具體來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX EP C18色譜柱(3.0×100mm，1.8μm)，流動相乙腈（B）-0.1%磷酸水(A)，按下表2進行梯度洗脫，流速0.6mL·min-1，檢測波長280nm，柱溫30℃，進樣量1μL。

表2 流動相梯度表

2.2 對照品溶液的制備

取militarine對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為0.984mg·mL-1的對照品溶液，冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末約0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷至室溫，稱重，以70%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S11），按“2.1”項下方法連續(xù)進樣6次，記錄其特征圖譜。將測量結(jié)果采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）”軟件分析色譜圖，并計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值（見表3、4）。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD值為0.064～0.501 %之間、相對保留峰面積的RSD值為1.091～3.465% 之間，符合特征圖譜技術(shù)要求（RSD＜5%），表明儀器精密度良好。

表3 精密度試驗相對保留時間結(jié)果

表4 精密度試驗相對峰面積結(jié)果

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一供試品（S11）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣測定，將測量結(jié)果采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）”軟件分析色譜圖，并計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值（見表5、6）。各色譜峰相對保留時間的RSD值為0.020～1.545 %之間、相對保留峰面積的RSD值為1.252～3.695% 之間，符合特征圖譜技術(shù)要求（RSD＜5%），表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗相對保留時間結(jié)果

表6 重復(fù)性試驗相對峰面積結(jié)果

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（S11），在0、2、4、8、12、24h分別進樣，按“2.1”項下方法測定，將測量結(jié)果采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）”軟件分析色譜圖，并計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值（見表7、8）。各色譜峰相對保留時間的RSD值為0.035～0.135 %之間、相對保留峰面積的RSD值為0.851～3.340% 之間，符合特征圖譜技術(shù)要求（RSD＜5%），表明供試品溶液在24h內(nèi)檢測結(jié)果差異較小，穩(wěn)定性良好。

表7 穩(wěn)定性試驗相對保留時間結(jié)果

2 0.5730.5720.5730.5720.5730.5720.111 3 0.5910.5900.5910.5910.5910.5900.117 4 0.6920.6910.6920.6910.6910.6900.097 5 0.7870.7860.7870.7870.7870.7860.070 6 0.9650.9640.9640.9640.9640.9640.035 7(S)1111110 8 1.1921.1931.1931.1941.1941.1930.042 9 1.3391.3401.3411.3421.3431.3420.106 10 1.5061.5071.5071.5061.5071.5060.044 11 1.6491.6511.6501.6501.6521.6500.055 12 1.7971.8001.8011.8021.8031.8010.112 13 1.8481.8511.8511.8511.8531.8510.086 14 1.9591.9631.9631.9651.9661.9640.128 15 2.0982.1022.1012.1022.1042.1010.099

表8 穩(wěn)定性試驗相對峰面積結(jié)果

2.5 白及與黃花白及特征指紋圖譜的建立及比較

2.5.1 白及特征指紋圖譜的建立 將14批白及按“2.3”項下方法制備供試品溶液，militarine對照品按照“2.2”項下對照品溶液配制方法進行配制，各供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄UPLC圖譜，見圖1。將上述所得的14批白及樣品圖譜進行統(tǒng)一積分后，將圖譜以AIA.格式依次導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件（2004 A版）”軟件，以S1（對照藥材）樣品為參照圖譜，中位數(shù)建立14批白及藥材的特征指紋圖譜，見圖2，共得到15個共有峰。將白及對照指紋圖譜（R）相似度指定為1，計算其他14批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜（R）之間的相似度值，在0.865～0.983之間，結(jié)果見表9。

表9 14批白及樣品的相似度

2.5.2 黃花白及特征指紋圖譜的建立 將“2.5”項下所得的14批黃花白及與3批小白及樣品圖譜進行統(tǒng)一積分后，將所有圖譜以AIA.格式依次導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件（2004 A版）”軟件，以S15樣品為參照圖譜，中位數(shù)法進行指紋匹配，建立了14批黃花白及藥材的指紋圖譜共有模式，見圖2，共得到15個共有峰。將黃花白及對照指紋圖譜（R）相似度指定為1，計算其他14批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜（R）之間的相似度值，在0.604～0.981之間，結(jié)果見表10。

表10 18批黃花白及與3批小白及樣品的相似度

2.6 白及與黃花白及的特征指紋圖譜的比較

2.6.1相似度評價 以“2.5.1”與“2.5.2”項下所得14個白及與14個黃花白及樣品特征指紋峰的相對峰面積值作為變量（下表11），采用“中藥指紋圖譜相似度評價軟件（2004 A版）”軟件對18批白及與18批黃花白及、3批小白及藥材指紋圖譜進行相似度計算。結(jié)果樣品S7與S11相似度較小以外（分別為0.628、0.745），其他樣品的相似度均大，說明整體上白及與黃花白及、小白及之間相似度較高，運用指紋圖譜較難區(qū)別開來。結(jié)果見表12。

圖1 空白溶劑、對照品、白及、黃花白及圖譜

圖2 14批白及樣品的UPLC指紋圖譜

圖3 14批黃花白及與3批小白及樣品的UPLC指紋圖譜

表11 14批白及、14批黃花白及與3批小白及藥材指紋圖譜共有峰相對峰面積

表12 18批白及、18批黃花白及與3批小白及樣品的相似度

2.6.2 聚類分析 運用SPSS21.0軟件對39批樣品進行系統(tǒng)聚類分析，將15個共有峰相對于參比峰峰面積量化，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用組間聯(lián)結(jié)法（average linkage between groups），以平方歐氏距離（Squared Euclidean distance）為度量標(biāo)準(zhǔn)，進行聚類分析，結(jié)果見圖4。由下圖可以看出，在距離為5時，除樣品S21、S29外，白及與黃花白及、小白及樣品均未分開，可見結(jié)果與相似度評價結(jié)果相一致。

圖4 14批白及、14批黃花白及與3批小白及樣品的聚類分析樹狀圖

圖5 14批白及、14批黃花白及與3批小白及樣品的主成分分析載荷圖

2.7 主成分分析

對31批樣品的15個共有峰相對于參比峰的峰面積量化后，對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS21.0軟件進行主成分分析，以主成分的特征值及貢獻率作為選取主成分的依據(jù)，主成分個數(shù)選取原則是取主成分相對應(yīng)的特征值大于1，從15個因素中總共選取了3個主成分，其累積貢獻率達到94.23%，包含了15個共有峰的大部分信息。圖5為14批白及樣品、14批黃花白及樣品及3批小白及樣品的載荷圖。由圖可以看出，除相似度較低的2批黃花白及樣品S21、S29分開較遠外，其他樣品均聚在一起，基本上區(qū)分不開白及、黃花白及和小白及，結(jié)果與聚類分析及相似度評價相一致。

3 結(jié)論與討論

3.1 本課題組對來自四川、貴州、云南的14批白及、14批黃花白及以及3批小白及進行特征指紋圖譜研究及比較。采用UPLC采集3個品種樣品化學(xué)成分的圖譜信息，并結(jié)合中藥特征指紋圖譜相似度評價軟件對各種內(nèi)樣品及種間樣品進行相似度評價，同時采用系統(tǒng)聚類方法進行聚類分析，并進行主成分分析。通過觀察白及與黃花白及之間的特征指紋圖譜，以保留時間作為定性鑒別依據(jù)，發(fā)現(xiàn)白及與黃花白及、小白及相似度較高，所含的共有峰基本一致，說明白及與黃花白及所含化學(xué)成分類似；將14批白及、14批黃花白及以及3批小白及合并在一起進行相似度評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除2批（S7、S11）白及樣品相似度較低外，其余29批樣品之間的相似度均高達0.85，提示白及與黃花白及、小白及相似度較高，聚類分析及主成分分析結(jié)果與相似度評價相一致。目前已有報道白及與黃花白及中化學(xué)成分、藥效等相似[2～4]，提出可將黃花白及收入藥典標(biāo)準(zhǔn)中作為白及藥材的另一來源，既規(guī)范白及藥材市場秩序，同時可緩解白及藥材資源匱乏問題，但相關(guān)研究較少，缺乏系統(tǒng)性研究。本研究通過特征指紋圖譜得出白及與黃花白及化學(xué)成分類似，從指紋圖譜來看區(qū)分不開，可為二者等同入藥提供參考依據(jù)；對于二者質(zhì)量等同性還需通過藥效學(xué)、安全性評價等作進一步研究。

3.2 根據(jù)2015版《中國藥典》中白及項下形狀描述，對幾批相似度較低的樣品進行分析發(fā)現(xiàn)，2批（S7、S11）白及樣品外觀與其他藥材相差甚遠，藥材干枯，無爪狀分支，易折斷，且斷面纖維性很重，角質(zhì)化弱或沒有，判斷這些樣品質(zhì)量較差；再結(jié)合圖譜分析，發(fā)現(xiàn)這兩個樣品所含共有峰較少，且各共有峰峰面積較小，所以導(dǎo)致相似度低。由此可見，該特征指紋圖譜能鑒別白及或黃花白及藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，為白及、黃花白及藥材品質(zhì)評價提供參考。

3.3本研究所用樣品大部分來源于藥材市場，部分樣品采自藥材種植基地。從藥材市場收集到的樣品魚目混雜，從形狀上很難鑒別品種，因此本實驗參考陳士林[5]方法，采用ITS2引物對所收集到的樣品進行

DNA鑒別，共鑒別18批白及，18批黃花白及與3 批小白及。

3.4 由以上結(jié)果可得出，白及、黃花白及、小白及所含化學(xué)成分類似，可為三者質(zhì)量等同性評價做一參考。本次試驗所用樣品數(shù)量有限，且產(chǎn)地集中在四川、貴州、云南3省，小白及樣品收集批次相差甚遠，后期應(yīng)加大樣本量，擴寬樣品來源范圍，進行深一步研究與探討。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015,103.

[2] 武坤毅.兩種白及內(nèi)生菌多樣性T-RFs指紋圖譜分析及與白及多糖含量相關(guān)性研究[D].陜西師范大學(xué),2013.

[3] 蘇鈦,李學(xué)芳,邱斌,等.滇產(chǎn)習(xí)用白及類藥材的生藥學(xué)研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2015,06:18-21.

[4] 趙艷霞,鄧雁如,張曉靜,等.白及屬藥用植物化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,08:1137-1145.

[5] 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國中藥，2013,38(2):141-148.

Study on UPLC fingerprints of Rhizoma Bletillae and Bletilla ochracea

/CHEN Mei-jun, LI Feng-qing, CHEN Hongping, LIU Jia-yu, LIU You-ping//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:This study was to establish the UPLC fingerprint of Rhizoma Bletillae and Bletilla ochracea,and compare the characteristics of the fingerprints to evaluate the equivalence property of the two varieties.Method:The chromatographic condition was as follows: Agilent ZORBAX EP C18(3.0×100 mm,1.8 μm) eluted with the mobile phases of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water in gradient mode. The flow rate was 0.6 mL·min-1, and the detection wavelength was set at 280 nm. The column temperature was 30℃ and sample size was 1μL. Similarity analysis was used to analyze the UPLC fingerprints of 14 batches of Rhizoma Bletillae and Bletilla ochracea. The common mode of the UPLC characteristic chromatographic profile was set up. There were 15 common peaks. 14 batch Rhizoma Bletillae, 14 batch Bletilla ochracea and 3 batch Bletilla formosana were merged together for similarity evaluation.Result:The results showed that except 2 batch Rhizoma Bletillae ( S7, S11) which did not reach the 0.85, the remaining similarity of 29 batch samples were 0.85 which indicated that the three varieties had a high similarity. The results of cluster analysis and principal component analysis were consistent with similarity evaluation.Conclusion:This method can be used to assess the quality of Rhizoma Bletillae. The fingerprint results show that Rhizoma Bletillae, Bletilla ochracea and Bletilla formosana contain similar chemical composition which can be used as a reference for the evaluation of the equivalence property of the three varieties.

Rhizoma Bletillae; Bletilla ochracea; characteristic fingerprint; UPLC; quality equivalence

R 282

A

1674-926X(2017)05-003-07

四川省科技廳科技支撐計劃項目（2016SZ0038）；成都市科技局科技項目（2014-HM01-00407-SF）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

陳美君（1990-），女，在讀碩士，從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究Tel:15308091445 Email:275474711@qq.com

劉友平（1964-），女，博士，從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究Tel:(028)61800103 Email:liuyouping00@163.com

2017-03-23

（責(zé)任編輯：胡慧玲）