楊冰　李婷婷　楊伊涵　張煒　李小軍　李玉桑　從仁懷　唐和斌

摘要：指出了丁香油是從中藥丁香中提取出來(lái)的揮發(fā)油，文獻(xiàn)報(bào)道其主要作用是抑菌消炎，但尚未見(jiàn)有報(bào)道研究其鎮(zhèn)痛效果及可能機(jī)制。研究中用完全弗氏佐劑CFA注射大鼠足底皮膚誘致疼痛作為無(wú)菌性的可持續(xù)疼痛模型，檢測(cè)了丁香油的消炎特別是鎮(zhèn)痛作用；并在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了丁香油主要成分丁香酚對(duì)炎癥的抑制作用。研究證明：丁香油通過(guò)抑制COX|2上調(diào)，可以減輕CFA注射大鼠誘發(fā)的足底腫脹、熱痛覺(jué)過(guò)敏，表明丁香油具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為改善慢性疼痛藥物的潛質(zhì)。

關(guān)鍵詞：丁香油；抗炎；鎮(zhèn)痛；COX|2

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2017）20018204

1引言

慢性疼痛顯著地降低了罹患癌癥和糖尿病等慢性疾病病人的生活質(zhì)量，使得本來(lái)就重?fù)?dān)在身的生活雪上加霜。因而，在臨床研究中，如何能發(fā)現(xiàn)更有效的鎮(zhèn)痛藥是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[1，2]。另外，市售鎮(zhèn)痛藥常有很多副作用，如胃腸道反應(yīng)、嗜睡、瘙癢、成癮性和呼吸抑制等[3]。為此，尋找并發(fā)現(xiàn)新型高效的具有更高安全性的鎮(zhèn)痛藥也是醫(yī)藥界的一大難題。最近許多相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，某些中草藥或中草藥提取物能有效的治療或緩解疼痛，如苦參提取物，青風(fēng)藤提取物[4]，以及傳統(tǒng)上用于止痛的25種植物[5]。

本研究涉及的中藥丁香是桃金娘科番櫻桃屬植物丁香的干燥花蕾，又名公丁香，別名丁子香等。味辛、性溫，歸脾、胃、肺、腎經(jīng)；為食藥兩用中草藥，也是名貴香料[6]。丁香油是從丁香中分離提取得到的芳香性揮發(fā)油，是主要的抑菌成份。丁香油主要成分已經(jīng)鑒定出，分別是丁香酚、β-石竹烯和乙?；∠惴覽7]。丁香油主要用于化妝品，食品芳香劑、防腐劑，臨床主要用于牙痛、風(fēng)濕性疼痛及一些菌性炎癥[8]。

目前，尚未見(jiàn)評(píng)估丁香油改善炎性疼痛作用的研究。本研究利用大鼠的足底炎性疼痛模型，引入兩種不同的評(píng)價(jià)方法來(lái)測(cè)試丁香油抗炎和鎮(zhèn)痛作用。此外，還在細(xì)胞水平上檢測(cè)了與炎癥誘導(dǎo)密切相關(guān)的分子環(huán)氧化酶COX|2的表達(dá)水平[9]。

2實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1實(shí)驗(yàn)儀器

熱痛儀（意大利Ugo Basile）；足趾腫脹儀（成都泰盟）；水置換體積計(jì)（PV-200；成都泰夢(mèng)軟件有限公司，中國(guó)成都）；電泳儀（美國(guó)，BIO-RAD）；等。

2.2實(shí)驗(yàn)試劑

完全弗氏佐劑（CFA，美國(guó)Sigma公司）；生理鹽水（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)）；雙氯芬酸鈉（北京諾華）；丁香油和氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）丁香油的結(jié)果由無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣州。所有其他試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich，USA。

2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，將96只年輕雄性Wistar大鼠（190～250 g）在無(wú)病原體實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d，保證實(shí)驗(yàn)室12 h光-夜循環(huán)，溫度為22～25℃。許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005，合格證編號(hào)：No.42000600004036。

2.4實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1丁香油的分離提取

2.4.1.1蒸餾丁香油

將干燥丁香花蕾（購(gòu)自中國(guó)廣西藥品廣西中藥廣州藥業(yè)中藥廠）粉碎并與水以1 g∶10 mL混均。然后，在蒸汽蒸餾裝置中蒸餾混合物8 h得丁香油。

2.4.1.2 GCMS分析丁香油

將丁香油（0.103 g）置于裝有正己烷（色譜純）的10 mL容量瓶中定容并混均。取上述溶液0.5 μL進(jìn)樣到GC。檢測(cè)器為質(zhì)譜選擇性Agilent 5975 檢測(cè)器，并耦合GCMS分析裝置Agilent 7890（II）GC。用HP-5MS毛細(xì)管柱分離揮發(fā)性化合物。溫度由40℃ （1 min） 以5℃/min升到220℃，并保持1 min；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。分析丁香揮發(fā)油時(shí)，使用分流模式，比例為1∶60，噴射器溫度為240℃，所有樣品一式三份進(jìn)行分析。用正烷烴計(jì)算保留指數(shù)（RI），通過(guò)比較其RI相對(duì)于從HP-5MS柱獲得C4-C30正烷烴的值來(lái)鑒定組分；并將所得結(jié)果與NIST質(zhì)譜提供的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，當(dāng)質(zhì)譜和RI值良好匹配時(shí)，確定正確識(shí)別組分。

2.4.2炎癥性疼痛模型

將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（替代CFA的生理鹽水注射）和CFA誘發(fā)的炎性疼痛組（CFA注射），不同組詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)“結(jié)果”部分。將150 μL CFA皮下注射到大鼠左后足底部，誘導(dǎo)炎癥性疼痛；對(duì)照大鼠注射等體積生理鹽水。注射CFA后，將對(duì)照組大鼠隨機(jī)分為3組（對(duì)照組），分別在第1周，第2周或第3周結(jié)束時(shí)處死。同時(shí)將CFA組隨機(jī)分為CFA處理組（CFA），CFA處理連續(xù)灌胃雙氯芬酸鈉組（CFA+diclo，30 mg/kg/d，諾華，北京），以及CFA處理連續(xù)灌胃丁香油組（CFA+ Clove Oil，10 mg/kg）。這些大鼠也分別第1周，第2周或第3周結(jié)束時(shí)處死。

2.4.3炎癥評(píng)估

通過(guò)測(cè)量足底腫脹大小來(lái)評(píng)估炎癥程度。用水置換體積計(jì)（PV-200；成都泰夢(mèng)軟件有限公司）測(cè)量每只大鼠左足與其右足的體積，每只足被測(cè)3次，取其平均值。

2.4.4疼痛評(píng)分測(cè)試

全部行為評(píng)估均按照國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（IASP）的道德準(zhǔn)則進(jìn)行。所有行為測(cè)試都在雙盲條件下進(jìn)行。并且，所有行為測(cè)試均在以下時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行：CFA注射后1，2或3周；評(píng)估疼痛評(píng)分也是在雙盲情況下4人分別單獨(dú)完成。具體方法及過(guò)程請(qǐng)參看本實(shí)驗(yàn)室前期文章。

2.4.5熱痛覺(jué)過(guò)敏試驗(yàn)

為了確定給藥處理后大鼠對(duì)熱刺激的傷害感受反應(yīng)情況，使用足退縮反應(yīng)潛伏期（WRL）值來(lái)測(cè)量。即是，將動(dòng)物放在具有玻璃地板的塑料室中，使其適應(yīng)10 min；輻射熱源置于大鼠每只后足所在的玻璃地板下方。使用足底測(cè)試儀（Ugo Basile Srl，Varese，Italy）測(cè)量足WRL值精確到0.1 s。校準(zhǔn)光源強(qiáng)度，以在自然狀態(tài)下動(dòng)物在16～25 s范圍內(nèi)產(chǎn)生足退縮反應(yīng)為度。大鼠兩只后足每只測(cè)3次，取其平均值。計(jì)算每只后足的WRL值。測(cè)量時(shí)間設(shè)定為60 s。endprint

2.4.6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

選取NIH3T3細(xì)胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基加入10% CS作為完全培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。Western blot法測(cè)定細(xì)胞COX|2蛋白的表達(dá)水平：接種培養(yǎng)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期NIH3T3細(xì)胞系于35 mm皿中，經(jīng)不同濃度丁香酚干預(yù)2 h后，換液再加入400 ng/mL LPS和不同濃度丁香酚共處理24 h。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜，5%脫脂奶粉封閉，加入針對(duì)COX|2抗原的抗體；洗滌后加入相對(duì)應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，加入化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，分析目標(biāo)蛋白條帶光密度。

2.4.7統(tǒng)計(jì)分析

本文中所有行為測(cè)試結(jié)果（除非另有說(shuō)明）以平均值±SEM的形式表示為CFA注射足以及對(duì)照足的值。在Origin8.0（Originlab Corp.，MA，USA）進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni posttests統(tǒng)計(jì)分析。所有測(cè)試均為雙尾，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在所有圖中*，**或***分別表示P<0.05、0.01或0.001。

3結(jié)果

3.1鑒定丁香油的組成

本研究中使用的丁香油主要化合物是丁香酚（78.69%）、β-石竹烯（11.74%）、α-石竹烯（1.59%）、石竹烯氧化物（1.11%）等。描述主要化合物的數(shù)據(jù)如表1所示，將分離鑒定出的成分與文獻(xiàn)[7]對(duì)比發(fā)現(xiàn)，除文獻(xiàn)中乙酰基丁香酚（5.60%）含量較多外，丁香酚（70.61%）、β-石竹烯（18.91%）、α-石竹烯（2.12%）差別不大；考慮到丁香的來(lái)源、分離提取的方法以及所使用的儀器，這些差別是可接受的，也表明我們的鑒定結(jié)果是可靠的。

3.2丁香油減輕CFA注射誘發(fā)的大鼠后足炎性腫脹

為了評(píng)價(jià)丁香油的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，將應(yīng)用材料和方法部分描述的CFA注射大鼠模型進(jìn)行研究。如圖1（a）所示，在CFA注射前，在每組大鼠的右后足未觀察到腫脹。在CFA注射后，與對(duì)照組相比，大鼠注射的后足顯示出一定水平的腫脹（圖1（b），模型組233.68 ± 6.83%，對(duì)照組為103.47 ± 1.11%， n=19），且腫脹程度呈時(shí)間依賴性降低。給予不同的治療（陽(yáng)性藥組給藥雙氯芬酸鈉，30 mg/kg/d，n=19；丁香油組給藥丁香油，10 mg/kg/d 等同60 kg人給藥100mg /d，n=19），與模型組相比，腫脹程度降低得更快。更重要的是，在丁香油存在下，大鼠后足腫脹程度降低比陽(yáng)性藥組明顯增加，只在第21 d時(shí)腫脹程度降低不如陽(yáng)性藥組明顯（第7d，丁香油組159.29±4.67%，陽(yáng)性藥組164.64±3.70%；第14d，丁香油組133.10±3.74%，而陽(yáng)性藥組為141.09±5.61%；第21 d，陽(yáng)性藥組128.41±1.86%，而丁香油組為135.37±5.46%）。且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每組大鼠的左后足均未觀察到腫脹（圖1c）。對(duì)比陽(yáng)性藥組和丁香油組的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)丁香油的抗炎效果優(yōu)于雙氯芬酸鈉的抗炎效果。

3.3應(yīng)用丁香油部分恢復(fù)CFA注射大鼠誘發(fā)的疼痛

為了更好地表征不同給藥處理下大鼠炎癥相關(guān)的疼痛狀態(tài)，本研究中引入了疼痛評(píng)分試驗(yàn)。疼痛評(píng)分試驗(yàn)的詳細(xì)過(guò)程在前文已有描述。如圖2（a）所示，模型組CFA注射后，其疼痛評(píng)分從第0d 0.27±0.06被提高到第1 d 1.70±0.07，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)21 d保持在相對(duì)較高的水平（第21 d為1.06±0.18），表明CFA注射成功誘發(fā)大鼠后足顯著并可持續(xù)的疼痛。陽(yáng)性藥雙氯芬酸鈉給藥處理后，疼痛評(píng)分在第1 d下降至1.17±0.07，并進(jìn)一步下降。在第21 d降至0.72±0.17。丁香油給藥后，在第1 d將疼痛評(píng)分降低至1.39±0.12，然而，其后下降加快，在第21d將疼痛評(píng)分降低至0.58±0.13，與對(duì)照組（0.53±0.23）相當(dāng)，但超過(guò)雙氯芬酸鈉給藥的效果。表明丁香油能更好地減輕由CFA注射引起的炎性疼痛反應(yīng)。

注：對(duì)照組；模型組；陽(yáng)性藥（雙氯芬酸鈉）組；丁香油組。 *，**，***分別代表P<0.05，0.01，0.001。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示

接著考慮利用傳統(tǒng)的熱痛痛閾檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步評(píng)估丁香油改善炎性疼痛的作用。如圖2（b）所示，觀察到CFA注射后熱誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)快速而顯著的增敏，并隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐步回升。陽(yáng)性藥組給予雙氯芬酸鈉治療后，大鼠的熱痛閾值從第1d的33.22±2.67%到第14d的79.33±7.46%、第21d的100.86±13.16%，遞增約3倍。而給予丁香油治療后，大鼠的熱痛閾值從第1d的34.87±2.45%到第14d的78.66±4.32%、第21d的83.69±11.11%，遞增約2倍多。與陽(yáng)性藥組雙氯芬酸鈉的效果類似，丁香油對(duì)炎性疼痛也顯示較好的效力。

注：數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。

3.4丁香油應(yīng)用在細(xì)胞水平上抑制COX|2表達(dá)

眾所周知，丁香油具有抗致病性真菌、葡萄球菌、痢疾和大腸桿菌等多種微生物的功效；并早已應(yīng)用于牙痛、皮膚病、菌類引起的炎癥等。在本文前面已經(jīng)證實(shí)，丁香油中主要成份為丁香酚，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是相符的。前人研究表明：丁香酚是丁香油中起作用的主要成份。目前，已經(jīng)證明CFA注射可誘導(dǎo)大鼠COX|2表達(dá)[10～12]。LPS為較為常用的炎癥誘導(dǎo)劑。為了檢測(cè)丁香油的應(yīng)用是否是通過(guò)抑制COX|2來(lái)減輕疼痛，我們擬用丁香酚和LPS刺激NIH3T3細(xì)胞，收集蛋白并用蛋白雜交檢測(cè)COX|2的表達(dá)。如圖3所示，COX|2的表達(dá)量在丁香酚和LPS處理后有所變化。單獨(dú)LPS處理后NIH3T3細(xì)胞內(nèi)COX|2表達(dá)顯著上調(diào)；丁香酚和LPS共同刺激后，隨丁香酚的濃度增加COX|2表達(dá)顯著下調(diào)。提示丁香酚可抑制NIH3T3細(xì)胞的COX|2表達(dá)，且抑制能力與其濃度正相關(guān)；進(jìn)一步提示丁香油是通過(guò)抑制CFA注射大鼠誘導(dǎo)的COX|2表達(dá)上調(diào)來(lái)減輕疼痛。endprint

4結(jié)論及討論

4.1結(jié)論

本文已經(jīng)證明丁香油可以通過(guò)抑制COX|2的表達(dá)上調(diào)來(lái)潛在地緩解CFA注射大鼠誘發(fā)的關(guān)節(jié)腫脹和熱痛覺(jué)過(guò)敏，因此丁香油有望成為一種緩解慢性炎癥和疼痛的潛在藥。

注：不同濃度丁香酚和LPS處理鼠源NIH3T3細(xì)胞后蛋白雜交得到的COX|2表達(dá)及定量圖。數(shù)據(jù)均以平均值 ± SEM表示

圖3丁香油通過(guò)抑制COX|2表達(dá)來(lái)緩解疼痛

4.2討論

丁香油主要成分為丁香酚，其也是藥物活性的主要成分。丁香酚有多種藥理藥效作用，但也存在一些毒副作用：例如有一定的腐蝕性；有刺激性，其會(huì)引起呼吸綜合癥；誤食后其會(huì)導(dǎo)致代謝性酸中毒[13]。有報(bào)道稱，丁香酚用于牙痛時(shí)會(huì)引起慢性蕁麻疹、接觸性蕁麻疹、變應(yīng)性接觸性皮炎等過(guò)敏反應(yīng)[14]。在該研究中，丁香油用量較小；并且在實(shí)驗(yàn)中，大鼠用丁香油處理后，沒(méi)有觀察到其任何異常行為。因此，本研究中使用的丁香油至少對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的。為了人類的進(jìn)一步使用，應(yīng)進(jìn)行更多的毒性和安全性實(shí)驗(yàn)。

在本研究中，大鼠經(jīng)CFA注射后成功地在熱和觸覺(jué)刺激下產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)（疼痛評(píng)分試驗(yàn)檢測(cè)到大鼠在行走期間的恢復(fù)行為，其可被視為觸覺(jué)應(yīng)激反應(yīng)），表明CFA注射可致如前所述的疼痛[15]。然而，與以前的研究不同，本研究中CFA注射大鼠后3周，依然檢測(cè)到相對(duì)持久的異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏。數(shù)據(jù)顯示，在第3周特別是模型組的測(cè)試大多數(shù)沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平，表明CFA注射對(duì)大鼠的影響至少可持續(xù)3周。

雙氯芬酸鈉屬于非甾體類抗炎藥，其是最常用的鎮(zhèn)痛藥之一[16]。其作為抗炎鎮(zhèn)痛藥，它可能是前列腺素最有效的抑制劑；常用于治療風(fēng)濕性疾病[17]和術(shù)后止痛[18]等。然而，諸如頭痛、頭暈、皮疹、水腫以及對(duì)腎肝的潛在損傷等副作用限制了其臨床應(yīng)用。為此，人們進(jìn)行了許多研究，嘗試用其他物替代雙氯芬酸鈉，如維生素B和維生素E[19]。除副作用外，雙氯芬酸鈉（30 mg/kg/d）在抗炎方面不如該研究中觀察到的丁香油那樣有效。相比之下，丁香油在抗炎方面表現(xiàn)更好。

多年來(lái)，人們一直認(rèn)為COX|2在炎癥引起的疼痛中發(fā)揮重要作用，研究已經(jīng)表明，大鼠經(jīng)CFA注射后6 h，其COX|2蛋白和mRNA表達(dá)水平急劇升高[20]。然而，在本研究中已經(jīng)在細(xì)胞水平證明COX|2的上調(diào)可被丁香酚抑制，這表明丁香油具有緩解炎癥和慢性疼痛的作用。

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Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Clove Oil

Yang Bing1， Li Tingting1， Yang Yihan1， Zhang Wei1， Li Xiaojun1， Li Yusang1， Cong Ronghuai2， Tang Hebin1

（1.School of Pharmaceutical Sciences，South-central University for Nationalities，Wuhan，Hubei，430074，China；

2.Infinitus （China） Company Ltd.， Guangzhou， Guangdong， 510665， China）

Abstract： Chronic pain， or sometimes referred to as sustainable pain， could cause physical and mental suffering and hence reduce the life quality of patients with chronic diseases such as cancer and diabetes. In recent years， Chinese Medicine， the treasure of Chinese traditional physic， has drawn more and more attentions for the search of effective drugs that can suppress chronic pain. The drug effect of Clove oil， a kind of volatile oil extracted from a Chinese traditional medicine， Ding Xiang， or Syzygiumaromaticum L.， is mainly restricted in anti-bacterial activity according to current literatures. However， hardly any research has focused on the effect and detailed mechanism of its anti-inflammatory and analgesic effects. Therefore， in the current study， we used CFA-injected rats as a model of sterile chronic-pain and detected the anti-inflammatory and especially analgesic effects of clove oil. In addition， we proved in the cellular level that eugenol， the main ingredient of clove oil， could alleviate inflammation. All together， we have proven that clove oil could reduce the paw swelling and the pain hyper-sensation of rats injected with CFA by inhibiting the up-regulation of COX|2， all of which demonstrated a potential of clove oil to be further developed into a chronic pain killer.

Key words： clove oil； anti-inflammatory； analgesic effects； COX|2endprint